А.Н. Яцковский, Т.А. Белоусова, С.А. Жучков, В.И. Ноздрин – ЗАО «Ретиноиды», Москва, Россия;
Синтетическое пиримидиновое производное метилурацил (МУ) активизирует внутриклеточные биосинтетические процессы, в особенности синтез нуклеиновых кислот и белков [4, 7, 10, 11], стимулирует пролиферацию в клеточных популяциях [12], влияет на систему гуморального иммунитета [14], вызывает изменения клеточного состава периферической крови [9] и оказывает ряд других воздействий на организм. Лекарственные формы с МУ для перорального и наружного употребления нашли широкое применение в различных областях клинической медицины, в частности, в дерматологии и хирургии. Так, МУ хорошо зарекомендовал себя как средство, способствующее восстановлению целостности кожи при ожогах [8, 13], в том числе лучевых [5], язвах, включая лепрозные [2, 3] и лейшманиозные [15], операционных ранах [1]. Однако несмотря на актуальность обсуждаемого вопроса, экспериментальные морфологические исследования дерматотропных, в том числе ранозаживляющих, свойств МУ немногочисленны [6].
Учитывая, что предлагаемая мазь с МУ 3 % на водоэмульсионной основе (Стизамет®) предназначена прежде всего для стимуляции заживления повреждений кожи, изучение её специфической дерматотропной фармакологической активности выполняли на модели кожных ожоговых ран.
Исследование проводили на крысах-самках Вистар со средней массой 189,4±3,3 г. Термические ожоги вызывали путём наложения на 30 сек на кожу межлопаточной области спины, лишённой волосяного покрова, нагретого в течение 1 мин в кипящей воде (100 °С) медного куба массой 50 г с площадью соприкосновения 4 см2. Все манипуляции проводили под гексеналовым наркозом (80 мг/кг, в/б). Через сутки на месте ожогов возникали раны в виде изъязвлений, заполненных некротическими массами. К концу 1-й недели у всех животных на поверхности ран формировался первичный струп, который удаляли на 9-е сутки эксперимента.
Начиная со второго дня эксперимента и до момента заживления ран, на раневую поверхность ежедневно наносили 0,5 г мази с МУ ( 3 %) на водоэмульсионной основе (ВЭО); ежедневная разовая доза МУ при этом составляла около 80 мг/кг. Препаратом сравнения служила метилурациловая мазь 10 % на ланолин-вазелиновой основе (ЛВО), наносившаяся на раневую поверхность в том же количестве. В качестве контроля использовали крыс с ожоговыми ранами, не получавших мазь (без воздействия), и животных, которым на раны наносили мазевую ВЭО. Каждая из экспериментальных и контрольных групп включала по 12 животных.
В ходе эксперимента с интервалом 3–6 дней измеряли площадь раневой поверхности путём зарисовки краёв раны на приложенном к ней стерильном предметном стекле и последующей морфометрии с использованием полуавтоматической системы анализа изображений МОР-Videoplan (фирма Reichert).
Характер течения репаративного процесса оценивали визуально в дни измерений площади ран, а также по результатам гистологического исследования кожи, иссечённой из краёв раны в конце 3-й недели и по окончании эксперимента. На аппаратно-программном комплексе «ДиаМорф» (Россия) оценивали толщину росткового слоя эпидермиса в краях эпителизации ран по результатам не менее чем 150 измерений для каждой группы животных. В направлении от края эпителизации к центру раны в 3 полях зрения при увеличении 40 х 1,1 подсчитывали клеточную плотность дермы (суммарное число клеточных элементов в поле зрения), а также соотношение клеток воспалительного инфильтрата (полиморфноядерных, мононуклеарных) и фибробластов. О принадлежности клеток к соответствующим популяциям судили путём определения фактора формы, значения которого, по результатам предварительно проведённого исследования, варьируют для клеток фибробластического ряда в пределах 0,10–0,60, а для моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов – 0,61–1,0.
Статистическую обработку результатов всех исследований проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия средних считали значимыми с уровнем вероятности не менее 95 % (в таблицах отмечены звездочками: * – 95 %, ** – 99 %, *** – 99,9 %).
При аппликациях мазей с МУ уже в начале 2-й недели после нанесения ожоговых ран имела место более выраженная, в сравнении с контрольной группой животных без воздействия, тенденция к уменьшению площади раневой поверхности. В группе животных, получавших мазь с МУ 3% на ВЭО, эти различия приобретали статистически значимый характер в течение первой недели наблюдения, а в группе препарата сравнения – к 12-му дню эксперимента (табл. 1).
Экспериментальные группы | Дни наблюдений после начала аппликации мазей | ||||
---|---|---|---|---|---|
до аппликац | 3-й | 12-й | 18-й | 28-й | |
без воздействия | 5,78±0,23 | 5,45±0,30 | 2,52±0,25 | 1,32±0,07 | 0,85±0,12 |
ВЭО | 6,01±0,20 | 5,48±0,19 | 2,07±0,20 | 1,18±0,08 | 1,00±0,21 |
мазь с МУ 10% на ЛВО | 6,07±0,25 | 5,00±0,27 | 1,75±0,12* | 0,91±0,5* | 0,80±0,32 |
мазь с МУ 3% на ВЭО | 6,46±0,26 | 4,79±0,24* | 1,52±0,11** | 0,66±0,05*** | 0,27±0,10** |
Определение доли раневой поверхности по отношению к исходной площади раны позволило сопоставить скорости течения раневого процесса в экспериментальных группах животных. Установлено, что метилурациловая мазь 10 % на ЛВО обладает достаточно выраженным действием на этот показатель. Однако наибольшее влияние на скорость заживления ожоговых ран оказывает мазь с МУ 3 % на ВЭО (Стизамет®). На 28-е сутки эксперимента доля раневой поверхности для данной группы составила 4,2 % от исходной площади ран против 13 % – при аппликации препарата сравнения, 14,7 % – у животных без воздействия и 16,6 % – у животных, получавших мазевую основу, которая сама по себе практически не влияет на скорость репаративного процесса.
В прямой зависимости от скорости течения раневого процесса находятся сроки полного заживления ожоговых ран. В целом, на соответствующих этапах наблюдения процент животных с полной эпителизацией раневой поверхности был выше при использовании обеих мазей с МУ (табл. 2).
Экспериментальные группы | Дни наблюдений после начала аппликации мазей | ||||
---|---|---|---|---|---|
29-й | 33-ий | 36-ий | 40-ий | 44-ий | |
без воздействия | – | – | – | 25,0 | 37,5 |
ВЭО | – | – | 12,5 | 37,5 | 50,0 |
мазь с МУ 10% на ЛВО | 12,5 | 25,0 | 50,0 | 62,5 | 62,5 |
мазь с МУ 3% на ВЭО | 12,5 | 37,5 | 62,5 | 75,0 | 100 |
Ранее всего полная эпителизация раневой поверхности наблюдалась у отдельных животных при аппликации метилурациловой мази 10 % на ЛВО и мази с МУ 3 % на ВЭО (Стизамет®). Однако в последнем случае полное заживление ран у всех животных зарегистрировано значительно раньше, чем в остальных экспериментальных группах и у контрольных животных (рис. 1).
Одной из причин более быстрого заживления ожоговых ран при использовании мазей с МУ, вероятно, является его стимулирующее влияние на клеточную пролиферацию в эпителии кожи, на что косвенно указывают результаты измерения толщины росткового слоя эпидермиса. Так, через 3 недели после начала эксперимента у животных без воздействия и при аппликации мазевой основы этот показатель составил соответственно 25,8±0,8 мкм и 24,2±0,8 мкм. Толщина росткового слоя эпидермиса после использования мази Стизамет® в этот же период наблюдения составила 35,6±1,0 мкм, а при аппликации метилурациловой мази 10 % на ЛВО – 42,3±1,3 мкм. Вероятность различий с показателями в контрольных группах животных составила 99,9 %. Полученные данные свидетельствуют также о дозозависимом влиянии МУ на пролиферацию клеток эпидермиса в участках повреждения кожи. Характер течения раневого процесса варьировал в различных экспериментальных группах. Визуально нагноение ран в конце 1-й недели наблюдения отмечено у 25 % животных в группе без воздействия, у 16,7 % крыс при аппликации ВЭО и у 8,3 % животных при аппликации метилурациловой мази 10 % на ЛВО. Признаки нагноения ран при аппликации мази с МУ, приготовленной на ВЭО, в эти сроки визуально не наблюдались.
Рис. 1. Область ожоговой раны кожи у контрольного (без аппликаций) животного (А) и у крысы, получавшей аппликации мази Стизамет® (Б) на 46-й день эксперимента: А – край эпителизации (КЭ), в дерме (Д) присутствует серозно-гнойный экссудат (Экс); Б – полная эпителизация раневой поверхности (стрелка), дерма (Д) образована волокнистой соединительной тканью. Об.: 10.
Результаты макроскопического наблюдения нашли подтверждение при гистологическом исследовании образцов кожи, иссечённых из краёв ран в конце 3-й недели эксперимента. Во всех случаях в зоне раны отмечены признаки воспаления: гиперемия сосудов дермы под раневой поверхностью и её клеточная инфильтрация, выраженные, однако, неодинаково в различных группах. У контрольных животных часто наблюдался диапедез эритроцитов. В обеих контрольных группах и у животных, получавших метилурациловую мазь 10 % на ЛВО, отмечалось большое количество серозно-гнойного экссудата, содержащего преимущественно нейтрофильные лейкоциты и локализованного под поверхностными некротическими массами и вблизи края эпителизации. При использовании 3 % мази с МУ на ВЭО полнокровие сосудов было менее выражено, гнойный экссудат отсутствовал (рис. 2).
Рис. 2. Ожоговые раны кожи у крыс через 20 дней аппликаций мази с МУ 10 % на ЛВО (А) и мази Стизамет® (Б): А – под утолщенным краем эпителизации (КЭ) в дерме (Д) присутствуют скопления разрушенных полиморфноядерных лейкоцитов (стрелка) и серозный экссудат (Экс); Б – край эпителизации над грануляционной тканью дермы (Д), умеренно инфильтрированной лейкоцитами. Об.: 20.
Результаты анализа клеточного состава дермы под раневой поверхностью через 3 недели после нанесения ран (табл. 3) коррелируют с указанными выше особенностями течения раневого процесса при использовании разных мазей с МУ. Так, в сравнении с животными контрольных групп, суммарное число клеточных элементов в дерме, подсчитанное на поле зрения микроскопа, значимо снижается при аппликациях мази Стизамет®. При этом наблюдается отчётливо выраженный сдвиг в сторону клеток фибробластического ряда, что в совокупности свидетельствует о более быстром разрешении в этих условиях воспалительного процесса, развивающегося в месте ожога (рис. 3).
Экспериментальные группы | Клеточная плотность | Доля клеток | |
---|---|---|---|
воспалительного инфильтрата | фибробластического ряда | ||
без воздействия | 78,9±3,3 | 72,9 % | 27,1 % |
ВЭО | 87,3±6,3 | 67,5 % | 32,5 % |
мазь с МУ 10% на ЛВО | 83,3±5,7 | 60,9 % | 39,1 % |
мазь с МУ 3% на ВЭО | 47,4+3,5* | 48,4 % | 51,6 % |
Примечание: * – вероятность различий с группой животных без воздействия составляет 95 %.
Таким образом, в качестве возможных причин ранозаживляющего эффекта препарата Стизамет®, наряду со стимуляцией пролиферативных процессов в эпидермисе, являются модификация воспалительного процесса в сторону активации фибробластической реакции дермы, а, возможно, и модулирующее влияние МУ на иммунокомпетентные клетки кожи.
Рис. 3. Соотношение различных типов клеток (в %) в единице площади дермы через 3 недели после нанесения ожоговой раны и использования мазей с МУ.
Мази, содержащие метилурацил, оказывают стимулирующее влияние на процессы репаративной регенерации кожи, независимо от состава использованной для их приготовления основы.
Мазь метилурациловая 3 % на водоэмульсионной основе (препарат Стизамет®) стимулирует пролиферацию эпителия кожи в зоне повреждения. В сравнении с 10 % мазью с МУ на ЛВО, она отчётливо подавляет воспалительную и активирует фибробластическую реакцию дермы, что определяет её более выраженное стимулирующее влияние на заживление ожоговых ран.