Влияние накожного нанесения антисептика-стимулятора Дорогова на поведенческие реакции крыс

Г. А. Пьявченко1,3, П. Дутта3, Н. С. Новикова2, В. А. Пугач2, Е. А. Корнева2, В. И. Ноздрин1, 3

1Центр доклинических исследований (руководитель – к.б.н. Г. В. Трунова), ЗАО «Ретиноиды», г. Москва, Россия;
2Отдел общей патологии и патофизиологии (заведующая – д.б.н. О. В. Шамова), ФГБНУ «ИЭМ», г. Санкт-Петербург, Россия;
3Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии (заведующий – д.м.н., проф. В. И. Ноздрин), Медицинский институт ФГБОУ ВО «ОГУ имени И. С. Тургенева», г. Орёл, Россия.

Резюме

В опыте на 2-х месячных крысах-самцах линии Sprague Dawley показано, что местное накожное нанесение антисептика-стимулятора Дорогова (АСД) в низких дозах (0,5 г/кг/сут) в течение 1 недели сопровождается повышением двигательной и ультразвуковой активности животных. Эффект сопровождался увеличением содержания активированных, c-Fos-позитивных, нейронов цингулярной, моторной, инсулярной, пириформной коры и стриатума головного мозга.

Ключевые слова: АСД, c-Fos, кора, стриатум, Laboras, Sonotrack

Адрес для корреспонденции: gennadii.piavchenko@yandex.ru Пьявченко Г. А.

Обнаруженный в ранее проведенных исследованиях эффект АСД в дозе 4 г/кг/сут продемонстрировал выраженную активацию нейронов многих участков головного мозга, которая коррелировала с увеличением поведенческой активности крыс [5].

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния накожного нанесения АСД в низкой дозе (0,5 г/кг/сут) на функциональную активацию нейронов коры и стриатума головного мозга крыс.

Методика исследования

Опыт был поставлен на крысах-самцах линии Sprague Dawley (100-120 г, n=6 в группе) возрастом 2 месяца, полученных из питомника ФИБХ РАН «Пущино». Животных содержали в контролируемых по температуре, влажности, освещенности и бактериальной чистоте условиях вивария Центра доклинических исследований ЗАО «Ретиноиды» (ЦДИ) [4]. Исследование проводили в соответствии с основными принципами надлежащей лабораторной практики [3] согласно утвержденному плану исследования, заключению комиссии по этике ЗАО «Ретиноиды» и стандартным операционным процедурам ЦДИ. После двухнедельного карантина и заключения ветеринарного врача о допуске животных рандомизировали в 3 группы: 1 группа – интактные животные, 2 группа – животные, получавшие основу препарата, 3 группа – животные, получавшие 5% АСД на выстриженную поверхность кожи межлопаточной области спины площадью 4 см2 в дозе 0,5 г/кг/сут в вечерние часы в течение 1 недели. После этого осуществляли запись поведенческих реакций на комплексах Laboras и Sonotrack (Metris, Нидерланды). На основе полученных данных изучали двигательную активность и параметры ультразвуковых вокализаций (УЗВ) животных. Затем животных наркотизировали препаратом Золетил 100 (Vibrac, Франция) и после интракардиальной перфузии иммунофикса (Bio-Optica, Италия) на замороженных срезах толщиной 40 µm выявляли экспрессию c-Fos-гена авидин-биотиновым методом с детекцией 3,3’-диаминобензидином. Участки мозга на 13-17 уровнях срезов идентифицировали по атласу Paxinos and Watson [8] и осуществляли подсчет c-Fos-позитивных нейронов с помощью светового микроскопа Axioscop 2 (Carl Zeiss, Германия), камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision (об. 40, ок. 20). Статистический анализ проводили с использованием программного пакета Statistica 6.1. Достоверность отличий данных между группами оценивали с применением t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при P≤0,05.

Результаты исследования

Анализ двигательной активности показал, что животные, получавшие препарат, отмечают достоверное повышение продолжительности двигательных актов, скорости передвижения, пройденного расстояния и общего количества поведенческих актов (Таблица 1).

Таблица 1. Показатели поведенческих реакций животных.
Группы Продолжительность двигательных актов, сек Средняя скорость движения, мм/с Пройденное расстояние, м Общее количество поведенческих актов
Интактные животные 5,3±2,4 0,3±0,1 0,2±0,1 128±35,9
Животные, получавшие основу 27,2±3,1* 2,4±0,2* 2,1±0,3* 298,3±24,1*
Животные, получавшие препарат 97,6±9,9*,# 4,1±0,5*,# 4,9±0,3*,# 457,8±16,4*,#

* P≤0,05, по сравнению с интактными животными.
*,# P≤0,05, по сравнению с животными, получавшими основу препарата.

Данные по ультразвуковым вокализациям лабораторных животных также свидетельствуют об увеличении поведенческой активности в группе, получавшей препарат (Таблица 2).

Таблица 2. Показатели ультразвуковых вокализаций животных.
Группы Число криков Число надпороговых криков Средняя частота, кГц
Интактные животные 4,2±2,2 0 49,1±0,04
Животные, получавшие основу 7,1±2,3 1,4±0,3* 49,2±0,12
Животные, получавшие препарат 79,7±4,9*,# 6±1,2*,# 49,1±0,06

* P≤0,05, по сравнению с интактными животными.
*,# P≤0,05, по сравнению с животными, получавшими основу препарата.

Животные, получавшие препарат в дозе 0,5 г/кг, продемонстрировали более высокую степень активации (по числу c-Fos-позитивных нейронов) цингулярной, моторной, инсулярной и пириформной коре, а также – в стриатуме (Таблица 3). Наибольшая нейрональная активация отмечалась в моторной коре и стриатуме (Рисунок).

Таблица 3. Количество c-Fos позитивных нейронов корковых структур и стриатума крыс в поле зрения светового микроскопа, M±m.
Зоны головного мозга Группы
Интактные животные Животные, получавшие основу Животные, получавшие препарат
Цингулярная кора 0,8±0,1 3,4±0,2* 13,4±0,3*,#
Моторная кора 2,7±0,2 9,0±0,6* 40,3±1,4*,#
Сенсорная кора 4,6±0,2 9,8±0,4* 10,9±0,5*
Инсулярная кора 0 0 19,0±0,4*,#
Пириформная кора 0 3,6±0,2* 19,1±0,7*,#
Стриатум 0,6±0,1 2,6±0,3* 24,3±0,5*,#

* P≤0,05, по сравнению с интактными животными.
*,# P≤0,05, по сравнению с животными, получавшими основу препарата.

Фрагменты моторной коры крысы

A

Стриатум крысы

B

Рисунок. Фрагменты моторной коры (A) и стриатума (B) крыс, получавших 5% АСД. C-Fos-позитивные нейроны (примеры клеток – в овалах). Об. 40х, ок. 20х.

Антисептик-стимулятор Дорогова оказался эффективным средством в лечении таких кожных заболеваний, как атопический дерматит, экзема, нейродермит и др. [1]. Являясь субстанцией для наружного применения, он содержит большое количество органических веществ. Эффективной лечебной формой является 5% АСД [1]. Такая концентрация позволяет добиться позитивных терапевтических результатов и избежать сильных раздражений кожи.

Ранее проведенное исследование выявило нарастание функциональной активности и количества нейронов коры головного мозга крыс по мере взросления от молодых особей к взрослым, и постепенное уменьшение этих показателей к старости [6]. Обращая внимание на структурно-функциональную реорганизацию коры головного мозга у 1 месячных животных, для исследования были выбраны крысы в возрасте 2-х месяцев. В другом исследовании нами было показано, что накожное нанесение препарата с АСД в высоких дозах (4 г/кг/сут) в течение 1 недели повышает УЗВ и двигательную активность у крыс-самцов в возрасте 2-х месяцев. Эти показатели достоверно коррелировали с количеством активированных нейронов цингулярной, моторной, соматосенсорной, инсулярной, пириформной коры и стриатума головного мозга [5].

В настоящем исследовании накожное нанесение препарата в 8 раз меньшей дозе вызывало функциональные и морфологические изменения реактивности тех же структур, однако количество c-Fos-позитивных клеток выявлялось больше в моторной коре и стриатуме, а также пириформной и инсулярной коре, в то время как увеличение количества активированных нейронов в цингулярной и соматосенсорной коре было менее выраженным. Изменения в показателях двигательной и УЗВ активности продемонстрировали увеличение количества поведенческих актов. При этом средняя скорость передвижения и пройденное расстояние, а также количество надпороговых криков увеличилось меньше в сравнении с более высокой дозой препарата. Менее выраженная активация нейронов цингулярной коры, ответственной за сложные поведенческие и ультразвуковые реакции [9], отражает полученные физиологические данные. Отсутствие достоверных различий количества активированных клеток соматосенсорной коры в 2 и 3 группах исследования позволяет предположить незначительность факта неприятных (раздражающих, болевых и др.) ощущений от нанесения препарата.

Сходные данные были получены и другими авторами. Так в исследовании Sayin A. и др. [10], которые показали, что эстральный цикл у крыс сопровождается выявленным на приборах Laboras и Sonotrack повышением состояния тревожности и УЗВ активности, коррелирующих с увеличением количества c-Fos-позитивных нейронов в цингулярной коре и других структурах мозга, а введение антидепрессанта циталопрама все эти показатели снижает. Babaev O. и соавт. [7] в своей работе отмечали факт нарастания тревожного поведения и активации тревого-ассоциированных нейронов (c-Fos-позитивных) в участках мозга при деактивации белка нейролигина 2, играющего ключевую роль в активации ингибиторных синапсов мозга. Изменения содержания c-Fos-позитивных нейронов описано Ивашкиной О. И. и др. [2] в процессе обучения лабораторных мышей рефлексу замирания.

Таким образом, накожное нанесение крысам АСД в малых дозах вызывает повышение двигательной и УЗВ активности, сопровождающееся увеличением количества c-Fos-позитивных нейронов цингулярной, моторной, инсулярной, пириформной коры и стриатума без увеличения активации соматосенсорной коры.

Литература

  1. Белоусова Т. А., Лаврик О. И., Жучков С. А., Трунова Г. В. // Альманах «Ретиноиды». М.: изд. ЗАО «Ретиноиды». 2014. №33. С. 51-64.
  2. Ивашкина О. И., Торопова К. А., Иванова А. А. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015. Т. 160, №12. С. 689-692.
  3. Межгосударственный стандарт (ГОСТ 33044-2014) «Принципы надлежащей лабораторной практики», М., «Стандартинформ», 2015.
  4. Ноздрин В. И., Пьявченко Г. А. // Технологии живых систем. 2013. Т.10, №8. С. 31-37.
  5. Пьявченко Г. А., Пугач В. А., Новикова Н. С. и др. // Морфология. 2016. Т. 150. № 6. С. 13-19.
  6. Пьявченко Г. А., Шмаркова Л. И., Ноздрин В. И. // Морфология. 2015. Т. 147. № 3. С. 7-10.
  7. Babaev O., Botta P., Meyer E. et al. // Neuropharmacology. 2016. Vol. 100. P. 56-65.
  8. Paxinos G., Watson C. The rat atlas in stereotaxic coordinates. San Diego. Elsevier Academic Press, 2007.
  9. Paxinos G. The rat nervous system. San Diego. Elsevier Academic Press, 2004.
  10. Sayin A., Derinoz O., Yuksel N. et al. // Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 2014. Vol. 124. P. 180–187.

Все материалы