Ретинола пальмитат обладает способностью дозозависимо стимулировать реакции гуморального и клеточного иммунитета в ответ на действие бактериальных антигенов. Для проявления иммуностимулирующего эффекта необходимы дозы на 1-2 порядка более высокие, чем для проявления А-витаминных свойств. Иммуномодулирующее действие препарата затрагивает макрофаги, Т- и В-лимфоциты. Отмечено незначительное иммуносупрессивное действие ретинола пальмитата в отношении противовирусного иммунитета.

Влияние ретинола пальмитата на массу селезенки и содержание в крови лимфоцитов. Опыты поставлены на мышах-самках линии СВА, которым внутрибрюшинно 2 раза в неделю вводили ретинола пальмитат. На 21-й день из хвостовых вен у мышей забирали кровь, готовили мазки и подсчитывали в 1 куб.мм количество лимфоцитов с учетом их больших, средних и малых форм.

Итак, иммуностимулирующие свойства ретинола пальмитата появляются при введении веществ в умеренно повышенных терапевтических дозах.

Влияние ретинола пальмитата на показатели гуморального и клеточного иммунитета. Опыты по изучению влияния ретинола пальмитата на антителообразование и уровень ингибиторов в крови гипериммунизированных мышей введением бактериального антигена (Е.Coli) и вирусов гриппа показали, что ретинола пальмитат стимулирует выработку антител к бактериальному антигенут Е.Coli. Титр сывороточных антител нарастал с увеличением дозы введенного вещества. В отношении показателя естественного иммунитета, каким является титр интерферона по отношению к вирусным антигенам, ретинола пальмитат проявлял слабое иммунодепрессивное действие. Так у беспородных мышей-самок, получавших однократно внутримышечно в 0,4 мл косточкового масла 0,0012 г ретинола пальмитат (индуктор - вирус группа А/Н1N1), титр интерферона составил (1:256)√10; у мышей, получавших 0,4 мл растворителя титр интерферона равнялся (1:350)√58, и у не подвергавшихся воздействию витамином А - (1:267)√30.

Исследование способности клеток селезенки мышей с растущей опухолью РШМ-5 к спонтанному и стимулированному эритроцитами барана розеткообразованию показало, что у животных, получавших ретинола пальмитат, способность к стимулированному розеткообразованию возрастала почти в 4 раза. Эта способность сохранялась у мышей с растущей опухолью, но была менее выраженной. Так в опыте на мышах-самцах линии С57В1 обнаружено, что после однократного внутрибрюшинного введения 15 мг ретинола пальмитата в селезенке выявлялось 126√13 розеткообразующих на 1 млн клеток. Предварительная иммунизация эритроцитами барана повышала этот показатель до 474√38 (достоверность различий: Р<0,001). Введение самкам-мышам линии СВА с привитой опухолью РШМ-5 (сингенная модель) 0,3 мг ретинола пальмитата после иммунизации эритроцитами барана, повышало количество розеткообразующих клеток с 122√14 до 151√18. Из этих данных следует, что под действием ретинола пальмитата у экспериментальных животных повышается активность иммунокомпетентных клеток.

Способность витамина А повышать функциональную активность иммунокомпетентных клеток была проверена в реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Исследование показало, что у мышей, которым вводили ретинола пальмитат, местная иммуноклеточная реакция на действие туберкулина была выше. Так, измерение объемов задних лапок мышей-самцов линии F1 (С57Вl/6хСВА) после введения в подушечку лапки 0,01 ТЕ туберкулина (контрольное введение - 0,1 мл физиологического раствора, послужившего растворителем для туберкулина) позволило получить следующие результаты. У мышей, которым вводили внутрибрюшинно 2 раза в неделю 0,5 мл 0,2% раствор ретинола пальмитата (0,01 ЛД-50 в остром опыте), объем стопы задней лапки был более чем в 2 раза выше, чем объемы лапок у животных в контрольных сериях. В опыте он составил 192,1√3,7 мкл. У витаминизированных животных, которым вместо туберкулина вводили физиологический раствор, - 92√2,8 мкл. У мышей, получавших вместо витамина А косточковое масло, после введения туберкулина - 91,8√0,8 мкл, после введения физиологического раствора - 90,3√1,1 мкл. Все животные предварительно за 21 день были иммунизированы однократным внутрибрюшинным введением 0,5 мл 0,2% раствора БЦЖ.

Таким образом, ретинола пальмитат оказывает слабое иммуносупрессивное действие в отношении противовирусного иммунитета. Препарат стимулирует способность клеток селезенки к спонтанному и стимулированному розеткообразованию как у интактных животных, так и у животных-опухоленосителей. Ретинола пальмитат усиливает местную иммуноклеточную реакцию на действие туберкулина.

Влияние перорального введения ретинола пальмитата на содержание Т- и В-лимфоцитов. Исследование иммуномодулиурующих свойств ретинола пальмитата (оральное введение масляных растворов по 700, 1400, 2100, 7000, 14300 МЕ/кг/сут вместе с 1,5мг капсульной массы) проводилось путем анализа процентного содержания Т- и В-лимфоцитов в популяции селезеночных клеток методом иимунофлюоресценции с использованием прочного цитометра "EPICS-C".

В экспериментах использовали козьи антитела против Т-лимфоцитов мыши, и кроличьи антитела против иммуноглобулинов козы, меченные флюоресцеина изотиоцианатом (для выявления Т-клеток в непрямой реакции иммунофлюоресценции) и козьи антитела против иммуноглобулинов мыши, меченных флюоресцеина изотиоцианатом (в прямой реакции иммунофлюоресценции по выявлению В-лимфоцитов на основании наличия иммуноглобулинов на клеточной поверхности). Необходимые разведения антител готовили на забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% азида натрия. Все исследования проведены на взрослых половозрелых мышах-самцах F1(С57Bl/6xCBA) массой 18-20 г. Для каждой изученной группы n = 5. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации.

Лимфоциты селезенки выделяли центрифугированием суспензии спленоцитов в градиенте плотности фиколла и верографина. С этой целью готовили раствор верографина плотностью 1,077 г/мл и наслаивали суспензию клеток селезенки, полученную путем осторожной гомогенизации органа, разведенную забуференным фосфатами физиологическим раствором, на равный объем разделяющего раствора (5 мл на 5 мл) в центрифужных пробирках. Центрифугирование пробирок проводили при 400-430q в течение 20 минут при комнатной температуре и собирали интерфазу, содержащую лимфоциты, при помощи пастеровской пипетки. Полученную суспензию лимфоцитов отмывали в ЗФР и использовали для постановки иммуологических реакций.

Для постановки непрямой реакции иммунофлюоресценции выделенные лимфоциты ресуспендировали в ЗФР, доводя их концентрацию до 1-2 млн/мл и вносили по 100 мкл клеточных суспензий в У-образные лунки 96-луночного планшета для иммунологических реакций. Планшеты центрифугировали на холоде в течение 2 минутпри 1000 об/мин., супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 100 мкл козьих антител против Т-лимфоцитов мыши на ЗФРс 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,2% азида натрия. Клетки инкубировали с антителами при +4 С в течение 30 минут с периодическим осторожным встряхиванием. После окончания срока инкубации клетки центрифугировали при +4 С 2 минуты, осадок ресуспендировали в 150-200 мкл ЗФР, осаждали, подвергали повторной промывке и инкубировали в растворе кроличьих антител против иммуноглобулинов козы, аналогично первому этапу. После отмывки в ЗФР клетки ресуспендировали в растворе ослиных антител против иммуноглобулинов кролика, меченных флюоресцеина изотиоцианатом (третий этап) и инкубировали, как описано для первых двух этапов. После окончания последнего этапа обработки антителами клетки отмывали в ЗФР и фиксировали 1% формалином.

Иммуноглобулинпозитивные клетки выявляли в реакции прямой иммунофлюоресценции с козьими антителами против иммуноглобулинов мыши, меченными флюоресцеина изотиоцианатом. Клетки инкубировали с антителами аналогично методике, описанной для первого этапа непрямой реакции иммунофлюоресценции.

Процент клеток, дающих положительную реакцию, определяли в обоих случаях на проточном цитофлюориметре "EPICS-C". Анализировали не менее 1000 клеток в каждой пробе.

Влияние перорального введения ретинола пальмитата на функциональную активность макрофагов. Оценку способности ретинола пальмитата модифицировать функциональную активность перитонеальных макрофагов проводили в тесте с хемилюминесценцией после стимуляции форболмиристатацетатом. Опыты были поставлены на мышах-самцах F1 (С57ВI/6хСВА) массой 16-18 г. Каждая экспериментальная группа содержала по 6 животных. Ретинола пальмитат вводили перорально ежедневно в течение 10 дней из расчета 0, 1400, 2100, 7000 и 14300 МЕ/кг/сут. вместе с 1,5 мг капсульной массы. На следующий день после последнего введения препарата животных умерщвляли методом цервикальной дислокации. Выделение клеток перитонеального экссудата производили на ледяном фосфатном буфере, не содержащем ионов Са и Мg. От примеси эритроцитов избавлялись при помощи гемолитического буфера. Клетки трижды отмывали на холоду, после чего ресуспендировали в фосфатном буфере и вносили в кюветы для определения хемилюминесценции в конечной концентрации 1 млн/мл. В кюветы вносили также раствор Хэнкса без фенолового красного, содержащий 0,0003 М люминола, 0,1% глюкозы и 1% человеческого сывороточного альбумина, общим объемом 0,5 мл. Кюветы помещали в хемилюминометр 1251 ("LKB", Швеция). Измерение хемилюминесценции производили при +37 С и постоянном перемешивании кювет. После замера "спонтанной" хемилюминесценции во все кюветы вносили активатор - форболмиристатацетат в конечной концентрации 50 нг/мл ("Sigma", США).

Установлено, что способностью усиливать хемилюминесценцию имулированных макрофагов обладал ретинола пальмитат лишь в дозе 2100 МЕ/кг/сут. Как более низкие, так и более высокие дозы препарата такого эффекта не вызывали.

Ю.Т.Волков, С.М.Субботин, В.И.Ноздрин