К.Н. ПУСТОВАЯ¹, Г.А. ПЬЯВЧЕНКО^1,2, В.И. НОЗДРИН¹

¹ – АО «Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Ретиноиды», Балашиха, Московская область, Россия;
² – ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» (Сеченовский университет) Минздрава России, Москва, Россия;

Резюме

Актуальность исследования обусловлена планированием выделения в МКБ-11 в самостоятельное заболевание демодекоз и, вследствие этого, разработкой новых лекарственных препаратов для его лечения.

Цель исследования — изучение in vitro акарицидного эффекта препарата Д-18 (АО «Ретиноиды», Россия) в отношении клещей Demodex canis и Demodex folliculorum, выявленных у человека.

Материал и методы. Выделенных клещей на предметном стекле помещали в раствор глицерина и вплотную окружали препаратом Д-18, его мазевой основой и препаратом, содержащим ивермектин 1%. Под световым микроскопом наблюдали двигательную активность клещей до момента гибели, которую констатировали по отсутствию признаков движения.

Заключение. Препарат Д-18 обладал в большей степени выраженным акарицидным эффектом в отношении клещей вида Demodex canis в исследовании in vitro, чем препарат, содержащий ивермектин 1%. В отношении клещей Demodex folliculorum оба препарата обладали в равной степени выраженным акарицидным эффектом.

Ключевые слова: Demodex, акарицидный препарат, ивермектин.

Введение

Демодекоз – распространённое хроническое паразитарное заболевание, вызываемое клещами рода Demodex, поражающее людей и животных. Этот дерматоз занимает 7 место по частоте заболеваемости и составляет 2 – 5% всех кожных патологий. Известно более 65 видов клещей, однако до недавнего времени считали, что на коже человека обитают всего 2 из них: D. folliculorum и D. brevis. В настоящее время появляется информация об обнаружении также особей Demodex canis у человека [1, 2, 3].

Демодекоз собак является распространённым заболеванием, вызываемым железничными клещами вида Demodex canis. В большинстве случаев заболевание возникает у животных в возрасте до 1,5 лет. Важную роль в его патогенезе играют предрасполагающие факторы, такие как ненадлежащие условия содержания, наличие короткой шерсти, эндопаразитов, хронических заболеваний и др. Паразит имеет удлинённое тело сигаровидной формы с четырьмя парами располагающихся в передней части туловища коротких конечностей, поперечно-исчерченную светло-серую кутикулу. Самцы имеют размер – 0,22–0,25 мм, самки – 0,24–0,30 мм. Цикл развития клеща продолжается 20–35 дней и имеет 5 стадий: яйцо – личинка – протонимфа – дейтонимфа – имаго. Клещи обитают в сальных железах и волосяных фолликулах, вызывая атрофию клеток прикорневого влагалища, питаясь остатками эпителиальных клеток [4, 5]. Демодекоз собак является потенциально опасным для жизни животного системным заболеванием и классифицируется как локализованный (наличие пяти или менее очагов поражений) или генерализованный (шесть или более очагов поражения). Процесс диагностики заболевания не представляет сложности: проводят несколько глубоких соскобов кожи до появления капиллярного кровотечения, затем делают акарограмму с подсчётом количества яиц, личинок, нимф и имаго. Повышенное внимание уделяют локализации паразитов на морде и лапах, поскольку это самые распространённые участки обитания клещей. Наиболее благоприятный прогноз лечения характерен для локализованной формы, а при менее благоприятной, генерализованной, – проводится комбинированная терапия [6], включающая как местное акарицидное лечение, так и системную антибиотикотерапию (при наличии присоединения бактериальной инфекции).

Клещи вида Demodex folliculorum являются сапрофитами кожи человека, однако при определённых факторах (нарушение иммунорезистентности, проницаемости гистогематических барьеров, обострение хронических заболеваний, неблагоприятные внешние факторы) они могут переходить в паразитарную форму. Морфология этого вида широко изучена. Самки имеют длину около 0,40 мм, самцы 0,16 мм, тело покрыто хитиновой оболочкой. Кутикула клеща состоит из трех оболочек: внешней – эпикутикулы, средней – экзокутикулы и внутренней – эндокутикулы. Её толщина с возрастом увеличивается и составляет от 0,1 до 0,6 мкм. Благодаря наличию в ней поровых каналов она участвует в водном и газовом обменах, а также выполняет защитную функцию [7]. Жизненный цикл клещей составляет 15–25 дней. Самка клеща откладывает яйца и погибает, через 60 часов образуются личинки, которые, питаясь остатками клеток эпидермиса и кожным салом, в течение 40 часов превращаются в неподвижную протонимфу. Через 72 часа в кожных покровах можно обнаружить подвижную дейтонимфу, а через 60 часов взрослую половозрелую особь, которая живёт около 1–2 недель, откладывает яйца и погибает [8].

В ранее опубликованном клиническом случае выявления клещей Demodex canis у пациентки О. 48 лет [9] был получен соскоб с поражённых областей кожи лица. В соскобе наравне с клещами Demodex folliculorum были также обнаружены клещи Demodex canis. Из анамнеза стало известно, что пациентка в быту находится в тесном контакте с собаками. После назначения стандартной схемы лечения (системное и местное использование препаратов группы 5-нитроимидазолов [10]) и проведения повторной акарограммы было зарегистрировано отсутствие клещей рода Demodex в материалах соскоба [11]. Через полгода пациентка обратилась повторно. При осмотре выявлена сходная с прежней клиническая картина, и высказано предположение о возможном рецидиве заболевания в связи с реинвазией клещами Demodex.

Проведенная акарограмма вновь зафиксировала наличие клещей Demodex folliculorum и Demodex canis в материалах соскоба. Это послужило причиной для исследования in vitro акарицидного действия экспериментального препарата Д-18, а также сравнения его с препаратом, содержащим ивермектин 1%. Целью исследования стало изучение акарицидного эффекта препарата Д-18 (АО «Ретиноиды», Россия) в отношении клещей Demodex folliculorum и Demodex canis в эксперименте in vitro.

Актуальность

В МКБ-11 планируется выделение нового заболевания демодекоз [12], что активизировало разработку новых лекарственных препаратов в мировом фармацевтическом пространстве для его лечения. Согласуясь с концепцией импортозамещения, проводимого на российском фармацевтическом рынке, представляется целесообразной разработка отечественного препарата, который будет обладать высокой эффективностью в применении, а также значительно большей доступностью для пациента.

Цель

Исследование in vitro акарицидного действия препарата Д-18 (АО «Ретиноиды», Россия) в отношении клещей Demodex canis и Demodex folliculorum, полученных от человека.

Материалы и методы

Исследование проводили в экспериментальной биологической клинике АО «Ретиноиды» [13, 14] в соответствии с Принципами надлежащей лабораторной практики [15, 16]. Для исследования был отобран материал содержимого сально-волосяных комплексов, полученный при проведении соскоба с поражённых участков кожи лица у пациентки О. 48 лет. Под микроскопом взрослых особей выделяли и помещали в 50% водный раствор глицерина. Для опытов отбирали клещей с выраженной двигательной активностью тела, конечностей и ротового аппарата. Препаровальной иглой их перемещали из капли раствора глицерина на левую половину стекла и вплотную окружали препаратом Д-18, его мазевой основой или препаратом ивермектин 1% в зависимости от группы исследования. Под микроскопом каждые полчаса с момента окружения препаратами оценивали степень двигательной активности по ранее опубликованной методике [17]. Гибель клещей констатировали по отсутствию признаков движения. Микроскопическое исследование проводили на световом микроскопе Axioskop 2 (Carl Zeiss, Германия). Для оценки среднего времени гибели клещей Demodex применяли методы описательной статистики. Для определения достоверности межгрупповых различий информацию анализировали параметрическими или непараметрическими критериями в зависимости от типа распределения количественных данных. При определении нормальности использовали критерий Колмогорова–Смирнова, который показал, что во всех случаях распределение величин являлось нормальным. Это позволило применять среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (SE), а также t-критерий Стьюдента для оценки достоверности различий между группами. Расчёты проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Различия определяли при 5% уровне значимости.

Результаты

Результаты исследования акарицидного действия препарата Д-18, его основы и препарата сравнения, содержащего ивермектин 1%, на клещах Demodex canis и Demodex folliculorum представлены в таблицах 1 и 2.

^* – Достоверность различия изучаемого признака в сравнении с интактными клещами и клещами, окруженными основой препарата.

^* – Достоверность различия изучаемого признака в сравнении с интактными клещами, и клещами, окруженными основой препарата.

^# – Достоверность различия изучаемого признака в сравнении с клещами, окруженными ивермектином.

Как видно из таблиц, применение основы препарата Д-18 не оказывает статистически значимого воздействия на гибель клещей Demodex canis. Отмечено сходное по времени гибели акарицидное действие нового экспериментального состава Д-18 и препарата ивермектин 1%, однако клещи вида Demodex canis гибнут в условиях применения последнего несколько дольше.

Обсуждение

Демодекоз – паразитарное заболевание, возникающее в результате размножения клещей рода Demodex в коже. Локализованная форма демодекоза собак может исчезать спонтанно в течение 2–4 месяцев, в то время как генерализованная форма представляет угрозу жизни животных. У собак в возрасте до 2 лет выделяют: ювенильный генерализованный демодекоз, который является наследственным заболеванием, передаваемым аутосомальным рецессивным геном. У собак старше 2 лет эта патология носит название – демодекоз взрослых собак [18]. Сегодня наиболее распространенной является теория, согласно которой существует наследственный дефект Т-лимфоцитов, приводящий к повышенному размножению клещей рода Demodex. Если этот дефект выражен сильно, то следствием будет генерализованная форма демодекоза и выраженная недостаточность иммунной системы [6]. Также имеются сведения о попадании клещей крово- и лимфотоком в лимфоузлы, селезёнку, печень, почки, мочевой пузырь, кишечную стенку, лёгкие, щитовидную железу, мочу, кал, что свидетельствует о системности этой патологии [18].

В последнее время в практике врача дерматолога возросло число случаев выявления клещей рода Demodex, которые не всегда являются осложнениями сопутствующих заболеваний, таких как себорейный дерматит, розацеа, периоральный дерматит, алопеция, блефарит и др. Так, в 1995 году Б.Г. Коган и соавт. [19], а также M.J. Birnkrant et al. [20] высказали предположение, что демодекоз является хроническим паразитарным заболеванием. В дальнейшем эту точку зрения поддержали Ю.С. Бутов и О.Е. Акилов [21], а также Н.И. Сюч [22]. Т.М. Желтикова полагает, что состояние иммунной системы человека определяет течение демодекоза как самостоятельного заболевания или как симптома, сопутствующего основной патологии [23].

Известны клинические случаи выявления Demodex canis у человека [3, 9], а в литературе имеются сведения о большем генетическом родстве клещей Demodex folliculorum с Demodex canis, чем с видом Demodex brevis [24]. Из этого следует, что необходимо применение не только ранней диагностики заболевания, но и направленного этиологического лечения. В случае возможного возникновения признаков системности заболевания необходима комплексная терапия, включающая иммунологическое лечение.

Заключение

Анализ представленных результатов исследования акарицидного действия экспериментального лекарственного препарата Д-18, его основы и препарата сравнения на клещах Demodex canis и Demodex folliculorum в исследовании in vitro позволил сделать следующие выводы:

• клещи Demodex, помещённые в водный раствор глицерина, погибают в среднем за 7,5 часов;
• основа препарата Д-18 не оказывает достоверно значимого воздействия на гибель клещей Demodex;
• Д-18 и препарат ивермектин 1% вызывают гибель клещей Demodex обоих видов через 2–3 часа, в случае с Demodex canis препарат Д-18 обладает в некоторой степени более выраженным действием.

Таким образом, в проведённом исследовании показан акарицидный эффект от применения препарата Д-18, а также препарата ивермектин 1% в эксперименте in vitro на клещах Demodex canis и Demodex folliculorum.

Можно полагать, что собаки, инфицированные клещами вида Demodex canis, являются релевантными животными по отношению к человеку [25].

Литература

1. Бутов Ю. С., Акилов О. Е. Клинические особенности и вопросы классификации демодекоза кожи // Рос. журн. кожных и венерич. бол., 2003; № 2, С. 53–58 [Butov Ju.S., Akilov O.E. Clinical features and classification issues of skin demodicosis. Ros zhurn kozhnyh i venerich bol 2003; 2: 53–58].
2. Бутов Ю. С., Акилов О. Е. Роль иммунных нарушений в патогенезе демодекоза кожи // Рос. журн. кожных и венерич. бол., 2003; № 3, С. 65–68 [Butov Ju.S., Akilov O.E. The role of immune disorders in the pathogenesis of skin demodicosis. Ros zhurn kozhnyh i venerich bol 2003; 3: 65–68].
3. Esenkaya Tasbent F., Dik B. A dog related Demodex spp. Infestation in a student: a rare Demodex case. Mikrobiyol Bul. 2018; 52(2): 214–220. https://doi.org/10.5578/mb.66410.
4. Гламаздин И.Г., Федорченко О.А. Демодекоз. 2014. [Электронный ресурс] [Glamazdin I.G., Fedorchenko O.A. Demodecosis. 2014. Internet resource]. Ссылка активна на 24.01.2019. http://www.dachshund-land.ru/Veterinary/Demodex1.htm.
5. Бородулина И.В., Гонюхова А.С. Демодекоз у собак // Инновационные тенденции развития российской науки. Материалы VII Международной научно-практической конференции молодых учёных. 2015; С. 86–88 [Borodulina I.V., Gonyukhova A.S. Demodecosis in dogs // Innovatsionnye tendentsii razvitiya Rossiiskoi nauki. Materialy VII Mezhdunarodnoi nauchnoprakticheskoi konferentsii molodykh uchenykh. 2015; Р. 86–88].
6. Белова С. Демодекоз у собак // Vetpharma, 2011, № 5, С. 28–33 [Belova S. Demodecosis in dogs. // Vetpharma, 2011, № 5, Р. 28–33].
7. Лавриненко М.В., Ревенко Ж.А. Современные представления о биологии, эпидемиологии, патогенезе и клинике демодекоза // Клиническая инфектология и паразитология, 2013, №4 (07), С. 118–126 [Lavrinenko M.V., Revenko Zh.A. Modern ideas about biology, epidemiology, pathogenesis and clinic of demodicosis // Klinicheskaya infektologiya i parazitologiya, 2013, № 4 (07), Р. 118–126].
8. Щеткина М.В. Клинические особенности, диагностика и лечение демодекоза кожи // Здравоохранение Дальнего Востока, 2018, № 1, С. 99–102 [Shchetkina M.V. Clinical features, diagnosis and treatment of skin demodicosis // Zdravookhranenie Dal’nego Vostoka, 2018, № 1, Р. 99–102].
9. Пустовая К.Н., Пьявченко Г.А., Ноздрин В.И. Применение препарата Дакарцид для лечения дерматита, ассоциированного с клещами Demodex canis у человека (in vitro исследование) // Дерматология в России, 2018, приложение № 3, С. 69–70 [Pustovaya K.N., P’yavchenko G.A., Nozdrin V.I. Use of the drug Dacarcid for the treatment of dermatitis associated with Demodex canis mites in humans (in vitro study) // Dermatologiya v Rossii, 2018, prilozhenie № 3, Р. 69–70].
10. Кубанова А.А. (ред.) Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путём // 5-е изд., перераб. и доп. М.: Деловой экспресс, 2016, С. 534 – 537 [Kubanova A.A. (red.) Federal clinical guidelines. Dermatovenerology 2015: Bolezni kozhi. Infektsii, peredavaemye polovym putem // 5-e izd., pererab. i dop. M.: Delovoi ekspress, 2016, Р. 534 – 537].
11. Пустовая К.Н. Случай обнаружения Demodex canis в практике врача-дерматолога // Альманах «Ретиноиды», Т. 35, 2019, С. 39. [Pustovaya K.N. Case of detection of Demodex canis in the practice of a dermatologist // Al’manakh «Retinoidy», Т. 35, 2019, Р. 39].
12. ICD-11 for Mortality and Morbidity Statistics. 2018. [Internet resource]. Ссылка активна на 29.01.2019. http://id.who.int/icd/entity/1473144548.
13. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (1973) [Sanitarnye pravila po ustroistvu, oborudovaniyu i soderzhaniyu eksperimental’no-biologicheskikh klinik (vivariev) (1973)].
14. Ноздрин В.И., Пьявченко Г.А. Опыт проведения доклинических исследований лекарственных препаратов дерматотропного действия // Технологии живых систем, 2013, Т. 10, № 8, С. 31 – 36 [Nozdrin V.I., P’yavchenko G.A. Experience in conducting preclinical studies of dermatotropic drugs // Tekhnologii zhivykh sistem, 2013, Т. 10, № 8, Р. 31 – 36].
15. Национальный стандарт Российской Федерации (ГОСТ 33044-2014). «Принципы надлежащей лабораторной практики», М, «Стандартинформ», 2015 [Natsional’nyi standart Rossiiskoi Federatsii (GOST 33044–2014). «Printsipy nadlezhashchei laboratornoi praktiki», M, «Standartinform», 2015].
16. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М: Медицина, 2005, 832 с. [Khabriev R.U. Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances – M: Meditsina, 2005, 832 p.].
17. Гутова В.П., Ноздрин В.И., Гузев К.С. и др. Способ оценки продолжительности жизни клещей Demodex folliculorum in vitro. Альманах «Ретиноиды», Т. 34, 2016, С. 62–64 [Gutova V.P., Nozdrin V.I., Guzev K.S. and others. A method for assessing the life span of in vitro mites Demodex folliculorum. Al’manakh «Retinoidy», Т. 34, 2016, Р. 62–64].
18. Scott DW., Miller WH., Griffin CE.: Muller and Kirk’s Small Animal Dermatol 6th Edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2001.
19. Коган, Б.Г., Степаненко В.И. Нарушения иммунного статуса организма больных розацеа, демодекозом и периоральным дерматитом с учётом патогенетического значения инвазии кожи клещами демодицидами // Украин. журн. дерматологии, венерологии, косметологии, 2005, № 1, С. 33–38 [Kogan, B.G., Stepanenko V.I. Impaired immune status of the body in patients with rosacea, demodicosis and perioral dermatitis, taking into account the pathogenetic significance of skin invasion with mites demodicides // Ukrain. zhurn. dermatologii, venerologii, kosmetologii, 2005, № 1, Р. 33–38].
20. M.J. Birnkrant et al. Pioderma gangrenosum, acne conglobata and IgA gammopathy // J. Dermatol. – 2003. – Vol. 42, № 3. – P. 213–216.
21. Бутов Ю.С., Акилов О.Е. Факторы успешной колонизации клещами Demodex spp. кожи человека // Вестн. последиплом. мед. образования, 2002, № 1, С. 87 [Butov, Yu.S., Akilov O.E. Factors of successful colonization by mites Demodex spp. human skin // Vestn. poslediplom. med. obrazovaniya, 2002, № 1, Р. 87].
22. Сюч Н.И. Лабораторная диагностика чесотки и демодекоза // М., 2003, С. 30 [Syuch N.I. Laboratory diagnosis of scabies and demodicosis // M., 2003, Р. 30].
23. Желтикова Т.М. Демодекоз – диагноз или симптом? // Медицинский вестник, 2006, № 38, С. 16 [Zheltikova T.M. Demodecosis - diagnosis or symptom?// Meditsinskii vestnik, 2006, № 38, Р. 16].
24. Hu L., Zhao Y.E., Cheng J., Ma J.X. Molecular identification of four phenotypes of human Demodex in China. Exp. Parasitol. 2014; 142:38–42. https://doi.org//10.1016/j.exppara.2014.04.003.
25. Решение совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 89 «Об утверждении Правил проведения исследований лекарственных средств Евразийского экономического союза», С. 77. [Reshenie soveta Evraziiskoi ekonomicheskoi komissii ot 03.11.2016 № 89 «Ob utverzhdenii Pravil provedeniya issledovanii lekarstvennykh sredstv Evraziiskogo ekonomicheskogo soyuza», Р. 77].