Е.К. Гузев^1,2, К.С. Гузев¹, докт. фарм. наук, Г.В. Раменская² докт. фарм. наук, профессор

¹ АО «Ретиноиды»
1111213, г. Москва, ул. Плеханова, д. 2/46, строение 5.
² Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
119991, г. Москва, ул. Большая Пироговская, д. 2, строение 4.

Резюме. Приведены результаты сравнительного изучения показателей «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии» в препаратах-дженериках клотримазола. Исследование субстанции проводили с помощью аппаратно-програмного комплекса «ДиаМорф» (Россия), а показатель «дисперсность эмульсии» на лазерном измерителе частиц Shimadzu SALD-201V (Япония). Обзорная микроскопия образцов препаратов выявило различия формы и размеров кристаллов лекарственной субстанции в препаратах от разных производителей. Контроль показателей «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии» характеризует качество препарата, а также подтверждает правильность проведения технологического процесса. Это служит отличительными признаками их индивидуальности и при необходимости позволяет либо выявить фальсификат, либо подтвердить авторство подлинного производителя.

Ключевые слова: показатели «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии», мази, дженерики, качество препаратов, производство лекарств, фальсификат.

В настоящее время в России зарегистрировано более 23 тыс. лекарственных средств – лекарственных препаратов и фармацевтических субстанций [2]. В то же время, по официальным данным, список международных непатентованных наименований не превышает 2000 [1]. Подобная ситуация объясняется присутствием на рынке лекарств большого количества препаратов-дженериков, охватывающих большинство лекарственных субстанций в разных лекарственных формах. При такой ситуации объективное исследование их биоэквивалентности приобретает особое значение. Однако прежде чем приступить к изучению фармакокинетики и биодоступности воспроизведённого препарата, целесообразно провести сравнительные фармацевтические исследования, т.к. они менее затратные и, в некоторых случаях, более информативны [5].

В связи с вышесказанным, наше внимание привлекла субстанция клотримазол, а точнее содержащий её 1% крем. Объясняется это следующими причинами. Во-первых, в Государственном реестре лекарственных средств РФ зарегистрировано 16 препаратов-дженериков с клотримазолом в лекарственной форме «крем 1% для наружного применения»; из них 9 наименований производится индийскими компаниями, 2 – немецкими, по одному наименованию – Румынией и Польшей и 3 наименования принадлежит российским производителям. Во-вторых, эта субстанция практически нерастворима в воде и должна находиться в креме в виде кристаллов. В третьих, комплекс вспомогательных веществ, технологические приёмы и используемое при производстве препарата оборудование отражаются на микроскопической картине крема, в результате чего она отличается индивидуальностью. В связи с этим было высказано предположение, что определение таких параметров мягкой лекарственной формы, как форма и размер кристаллов клотримазола, а также дисперсность жировой фазы мазевой основы позволит выявить различия между препаратами, качественно и количественно оценить их по показателям «размер частиц» и «дисперсность эмульсии», а также составить представление о производственном процессе и условиях хранения готовой продукции.

В настоящее время для анализа дисперсности гетерогенных систем используют метод лазерной дифракции (ЛД). Принцип работы оборудования, определяющего распределения частиц по размерам посредством ЛД, основан на рассеяния электромагнитных волн. Прибор, состоящий из лазера, луч которого через измерительную ячейку с измеряемыми частицами направлен на детектор. Свет, рассеянный пропорционально размеру частиц, с помощью линзы фокусируется на детектор. По распределению рассеянного света при помощи математической модели рассчитывают распределение частиц по их размерам. В результате получают объемные доли, соответствующие тем, или иным диаметрам частиц в образце. Данный метод широко используется за рубежом, т.к. его теория и практика развиваются с середины 80-х годов и к настоящему моменту издано значительное количество монографий и обзоров, описывающих работу подобного оборудования в сравнении с методами, основанными на других физических принципах [3, 4, 6].

Целью данной работы было проведение исследования показателей «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии» в 1% кремах с клотримазолом, изготовленных различными производителями.

Экспериментальная часть

Объекты исследования. Объектами исследования служили 5 образцов 1% крема с клотримазолом произведенных зарубежными компаниями и присутствующих в момент проведения исследования на фармацевтическом рынке России под различными товарными названиями. Для удобства изложения их пронумеровали цифрами от 1 до 5.

Критерии оценки. Препараты-дженерики сравнивались по составу вспомогательных веществ, внешнему виду, дисперсности кристаллов субстанции и дисперсности эмульсионных капель липофильной фазы.

Оборудование. Обзорную микроскопию проводили на микроскопе Микромед-1 (ЛОМО, Россия), снабжённом бинокулярным тубусом и отечественными объективами с увеличением 8× и 40×.

Исследование линейных размеров кристаллов субстанции клотримазола проводили с помощью аппаратно-програмного комплекса «ДиаМорф» (АПК ДиаМорф, Россия) с использованием программы компьютерного анализа изображения «Сito». Измерение проводили в ручном режиме.

Для измерения показателя «дисперсность эмульсии» использовали лазерный измеритель частиц Shimadzu SALD-201V (Япония).

Методики:

1. Методика приготовления микропрепарата для исследования показателя «Размер частиц». На предметное стекло наносили 0,2 г мази, накрывали его покровным стеклом и аккуратно придавливали, избегая сильного нажима. Препарат устанавливали в держатель столика микроскопа и изучали при различных увеличениях. Измеряли линейные размеры кристаллов клотримазола по их длине, не учитывая ширину и толщину; при этом пользовались методом постоянного направления перемещения микропрепарата вдоль горизонтальной оси.
2. Методика приготовления микропрепарата для исследования дисперсность: В стеклянный стакан отвешивали около 1 г препарата и 30 мл воды очищенной. Стакан устанавливали на магнитную мешалку и тщательно перемешивали смесь до получения однородной разбавленной эмульсии. Полученную эмульсию прибавляли по каплям в измерительную камеру до значения, необходимого для автоматического измерения. Из полученного протокола вручную формировали соответствующие группы, рассчитывали их долевое распределение и строили соответствующие графики.

Полученные результаты

Анализ вспомогательных веществ, согласно инструкциям по медицинскому применению (табл.1), показал, что первые 3 препарата имеют практически одинаковый набор вспомогательных веществ: липофильный компонент (вазелин, вазелиновое масло или их смесь), комплекс эмульгаторов (цетостеариловый спирт, цетомакрогол-1000), консервант (хлорокрезол, бензиловый спирт или смесь метил- и пропилпарабена), антиоксиданты с различным механизмом действия (динатрия эдетат, бутилгидрокситолуол, натрия метабисульфит), компоненты фосфатной буферной системы, пропиленгликоль и воду. Четвёртый и пятый образцы, также мало чем отличаются друг от друга. В четвёртом образце липофильная фаза состоит из вазелина, а в пятом из октилдодеканола – синтетического заменителя вазелина.

Таким образом, анализ комплекса вспомогательных веществ свидетельствует, что все препараты могут быть эмульсиями типа м/в и поэтому могут быть охарактеризованы как лекарственная форма «крем».

Обзорная микроскопия препаратов подтвердила их эмульсионный характер. Отчётливо, особенно при большом увеличении, видны плотно упакованные капельки масляной фазы. Исключение, в значительной степени, представляет собой образец 4. В качестве жировой фазы этот препарат содержит вазелин, который на микрофотографии представлен не в виде капелек, а в виде характерных «тяжей», охватывающих кристаллы субстанции. Кроме того, на представленных в таблице 2 фотографиях видно, что размер капель в кремах различен. Этот факт даёт нам основание предположить, что измерение дисперсности мазевых основ этих лекарственных средств позволит нам в дальнейшем идентифицировать их по этому показателю. В препаратах 1, 2 и 3-м образцах часть субстанции клотримазол находится в виде твёрдой фазы. Кристаллы клотримазола не обнаружены лишь в 5 образце. Это доказывает, что комплекс вспомогательных веществ, входящий в состав препарата, подобран правильно, а используемые технологические приёмы создают оптимальные условия для производства этого препарата. Напротив, 4-й образец содержит большое количество частиц клотримазола, представляющих собой плохо промешанные крупные конгломераты. Кристаллы имеют различную геометрическую форму и линейные размеры, что позволяет предположить, что субстанцию в мазевую основу вводили по суспензионному типу и в дальнейшем недостаточно тщательно её перемешали.

В препаратах 1–3 клотримазол находится в виде правильных кристаллов. Однако их форма и размер в разных образцах различаются, что можно объяснить отличиями в технологии их производства, т.к. состав препаратов принципиально одинаков. Однозначно можно сказать, что эти кристаллы образовались не в процессе производства крема, а после его приготовления – они имеют правильную форму (ромбы, параллелограммы, прямоугольники), характерную для кристаллов, полученных в процессе медленной рекристаллизации, а отсутствие сколов и изломов указывает, что процесс их образования проходил, вероятно, уже в тубе.

Таким образом, показано, что изученные лекарственные препараты, содержащие клотримазол, имеют эмульсионный характер и, несмотря на сходный состав, сильно отличаются друг от друга. Выявленные различия могут служить критериями их индивидуальности, а при необходимости позволят выявить фальсификат, либо подтвердить авторство подлинного производителя.

С помощью обзорной микроскопии удалось измерить линейные размеры кристаллов клотримазола в кремах, но только в образцах 1,2,3 (табл. 2)

При измерении кристаллов субстанции было обнаружено, что в 1-м образце крема кристаллы клотримазола встречается редко и виден лишь при большом увеличении. С большим трудом удалось обнаружить 63 объекта измерения. размер которых варьировал от 10,1 до 44,7 мкм при средней его величине в 21,8 мкм и стандартном отклонении 7,3 мкм. Во 2-м образце кристаллы клотримазола встречаются так же редко, как в образце 1, но они имеют значительные размеры. Амплитуда их колебания составляет 29,5–86,8 мкм, что в среднем равняется 57,6 мкм, со стандартным отклонением 14,2 мкм. В 3-м образце кристаллов клотримазола много, они равномерно распределены по всему объёму крема и легко поддаются подсчёту. Их размеры изменяются от 10,8 до 51,5 мкм, средняя величина составляет 24 мкм и стандартное отклонение – 6,1 мкм.

Распределение измеренных кристаллов по группам представлено на рис. 2.

Установлено также, что показатель «Размер частиц» в кремах индивидуален для каждого производителя. В креме производителя 1, группы кристаллов от 10 до 19 мкм и от 20 до 29 мкм составляют по 41,3%, а группа с кристаллами, имеющими размеры от 30 до 39 мкм – 15,9%. Группы кристаллов более 40 мкм как в первом, так и во втором препарате незначительны и не превышают 2%. В образце 2 кристаллы клотримазола имеют самые большие параметры. Максимальное количество кристаллов составляют группы с размерами от 50 до 59 мкм (35,5%) и от 60 до 69 мкм (19,4%). У производителя 3 группа кристаллов от 10 до 19 мкм составляет 18,3%, от 20 до 29 мкм – 60,3%, группа кристаллов от 30 до 39 мкм – 19,6%, что в сумме равно 98,2%.

Таким образом, изученные препараты отличаются друг от друга не только по внешнему виду кристаллов, но и по их долевому распределению в означенных группах.

При анализе протоколов по исследованию дисперсности обращали внимание на максимальные и минимальные размеры эмульсионных капель. Из данных таблицы 3 видно, что минимальные размеры масляных капель эмульсии у всех производителей мало чем отличаются друг от друга, чего нельзя сказать об эмульсионных каплях, имеющих максимальные размеры.

Анализ результатов измерения дисперсности кремов клотримазола показал, что по распределению капель жировой фазы препараты разделяются на две группы (рис. 3). В первую группу (а) входят препараты производителей 2, 4, и 5. Их распределение имеет вид нормального со сдвигом влево. Основной вклад в дисперсность этих эмульсий вносят капли с размером от 0,5 до 3,0 мкм, их суммарное количество изменяется в пределах от 80 до 93%. Дисперсность образцов препаратов 2-й группы (б), принадлежащих производителям 1 и 3, имеют иное распределение. Основную часть эмульсии в них также составляют капли размером от 0,5 до 3,0 мкм, однако их доля в общем распределении капель составляет уже 91–97%.

Как показало изучение показателей «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии», мазевых форм характерны их большие значения. Результате исследования позволяют отличить продукцию одного производителя от продукции другого, дать качественную и количественную характеристику субстанции, находящейся в лекарственной форме, а также количественно оценить дисперсность эмульсии в лекарственном препарате.

На следующем этапе исследования дополнительно оценивали постоянство этих показателей в различных сериях препарата, выпущенного одним производителем, и динамику изменения этих показателей в процессе хранения в различных температурных условиях. Это позволит оценить постоянство проведения технологического процесса: методы подготовки субстанции и способы её введения в мазевую основу, время диспергирования полупродукта, а также оптимальный режим хранения готового крема.

Исследовали 4 серии 1% крема с клотримазолом, выпущенные одним и тем же производителем.

Согласно результатам исследования препаратов под световым микроскопом (см. рис. 4) показало, что во всех сериях кремов кристаллы субстанции имеют одинаковую и характерную колоннообразную форму. Способ введения субстанции в основу постоянен – в основу клотримазол вводят в виде раствора. Формирование обнаруженных кристаллов идёт в процессе хранения крема в фасованном состоянии. Все серии препарата имеют эмульсионный характер, что свидетельствуют о постоянстве состава и технологических приёмов (гомогенизация).

Статистическая обработка линейных размеров измеренных кристаллов субстанции (табл. 4) свидетельствуют об их идентичности.

Распределение параметров по группам, представлено на рисунке 4. Видно, что общая картина их распределения от серии к серии не изменяется; причём, разброс рассчитанных долей практически не отличается друг от друга. Этот результат свидетельствует, что показатель «Размер частиц» для крема клотримазола является устойчивым параметром и может служить его отличительной характеристикой.

Результаты измерения дисперсности (рис. 5) выявили следующую закономерность: распределение капель эмульсии в препарате серий 178, 182 и 183 имеет общую картину; максимальную долю составляют частицы диаметром от 1 до 1,5 мкм, а доля частиц размером от 1,6 до 3,0 мкм составляет 90–95%. Однако дисперсность в серии 175 отличается от распределения частиц в других сериях лекарственного препарата. Максимальную долю частиц в этом образце (48,5%) составляют капли диаметром от 0,5 до 0,99 мкм, а на долю частиц с размерами до 3 мкм приходятся остальные 50%. Можно предположить, что при производстве 175-й серии препарата, произошёл сбой режима в постоянно проводимом технологическом процессе. Обнаруженное увеличение доли частиц малого размера возможно всего в двух случаях: во-первых, при повышении температуры гомогенизированной смеси (она становится менее вязкой, что облегчает её гомогенизацию) и, во-вторых, – при увеличении времени гомогенизации.

Таким образом, контроль 3 показателей качества (обзорная микроскопия мази, «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии») позволяет идентифицировать производителя, охарактеризовать качество мази и подтвердить правильность проведения технологического процесса её приготовления.

Принимая во внимание, что температура хранения крема допускает довольно широкий интервал – от +2 до +30 °С, изучали возможный рост кристаллов клотримазола в креме, который на 7 дней поместили в камеру с температурой +7 °С. Препаратом сравнения служил тот же крем, но хранившийся при температуре +20 °С.

В процессе хранения лекарственного препарата при +7 °С отмечено изменение распределения кристаллов субстанции в сторону увеличения их размеров в сравнении с распределением кристаллов в этом препарате, хранившемся при 20 °С (Рис. 6). Так, если доля группы кристаллов субстанции с размером от 10 до 19 мкм в креме, хранившемся при комнатной температуре, составляет лишь 18,9%, то после пребывания препарата в условиях пониженной температуры доля этой группы кристаллов уменьшилась до 5,3%. В то же время доля кристаллов длиной от 20 до 29 мкм, от 30 до 39 мкм и от 40 до 49 мкм возросла в среднем на 5%. Полученный результат свидетельствует, что в изучаемом препарате нет необходимого для лекарственных препаратов равновесия между клотримазолом, находящимся в кристаллическом и растворённом состояниях. В зависимости от температуры его хранения это равновесие сдвигается то в сторону увеличения размеров твёрдой фазы, то в сторону их уменьшения. Учитывая биофармацевтические аспекты приготовления и применения лекарственных средств, можно с большой долей уверенности сказать, что изменение соотношения между растворённой и кристаллической фазами субстанции в препарате не может не менять его биодоступность, что в свою очередь изменяет эффективность применения самого лекарственного средства. Для устранения этого положения целесообразно сузить интервал температуры хранения препарата.

Выводы

1. Анализ вспомогательных веществ в препаратах-дженериках даёт возможность оценить тип эмульсии и подтвердить правильность квалификации производителем названия лекарственной формы.
2. Световая обзорная микроскопия образцов препаратов выявляет различия формы и размеров кристаллов лекарственной субстанции в препаратах от разных производителей, что служит отличительными признаками их индивидуальности и при необходимости позволяет либо выявить фальсификат, либо подтвердить авторство подлинного производителя.
3. Контроль показателей «Размер частиц» и «Дисперсность эмульсии» характеризует качество препарата, а также подтверждает правильность проведения технологического процесса.
4. Присутствие в мази лекарственного вещества в виде кристаллов требует доказательного отношения к температурному интервалу хранения препарата.

Литература

1. Шашкова Г.В., Лепахин В.К., Бешлиева Е.Д. Электронный справочник синонимов лекарственных средств М.: РЦ Фармединфо, 2012;
2. Электронная база Минздрава РФ
3. Shekunov Boris Y., Chattopadhyay Pratibhash, Tong Henry H. Y. , Chow Albert H. L. Particle Size Analysis in Pharmaceutics: Principles, Methods and Applications. Pharmaceutical Research. 2007. – Vol. 24. – Issue 2. – pp 203–227;
4. Stanley-Wood N G, Lines R W. Particle Size Analysis, 1992. – 558 p.
5. Taylor PW & Keenan MHJ. Pharmaceutical quality of generic isotretinoin products, compared to Roaccutane // Current Medical Research and Opinion. – 2006. – Vol. 22. – P. 603–615.
6. Washington C. Particle size analysis in pharmaceutics and other industries. Theory and practice. Ellis Horwood series in pharmaceutical technology . CRC Press, 2005. 260 p.