Ретиноевая мазь, содержащая 13цРК, - препарат с высокой биологической активностью, который у животных может повреждать ряд жизненно важных органов. В дозах, эквивалентных таковым у человека, вещество в мази не токсично. Мазь не оказывает аллергизирующего, канцерогенного и мутагенного действия. В повышенных концентрациях она обладает местнораздражающим эффектом. Витамин Е и гидрокортизон снижают побочное действие 13цРК.

Острая токсичность

В опытах на мышах острая токсичность 13-цис-ретиноевой кислоты (13цРК), как субстанции, составила 260 мг/кг (ЛД₅₀), что существенно превышает аналогичное свойство ряда других ретиноидов (см. таблицу 1).

Определить острую токсичность ретиноевой мази не удалось из-за невозможности достичь необходимой концентрации субстанции в мазевой основе. Вместе с тем, подострая токсичность мази, выявленная в опытах на лабораторных грызунах (крысах, мышах, морских свинках), оказалась достаточно высокой. Так, например, ежедневное накожное нанесение 0,5 г 0,5% ретиноевой мази сопровождалось гибелью 86% использованных в опыте крыс Вистар уже после пятой аппликации.

Хроническая токсичность

Изучение хронической токсичности было проведено на лабораторных грызунах, которым накожно наносили по 0,5 г ретиноевой мази. Концентрация 13цРК и сроки аппликаций приведены ниже в описании конкретных экспериментов.

Периферическая кровь. Аппликацию 0,1% ретиноевой мази крысам-самкам Вистар массой 200-230 г проводили ежедневно в течение 10 суток. В периферической крови выявлено небольшое увеличение доли нейтрофилов и снижение доли лимфоцитов. Последнее, вероятно, отражает иммуномодулирующее действие субстанции, связанное со стимуляцией миграции лимфоцитов в ткани.

Биохимические показатели крови. Крысам-самкам Вистар массой 220-240 г ежедневно в течение 14 суток наносили мази, содержащие 0,003%, 0,03% и 0,3% 13цРК. В крови исследовали содержание глюкозы, белка, креатинина, билирубина, холестерина, трансаминаз, щелочной фосфатазы и мочевины. Установлено, что применение указанных мазей в течение 2-х недель не вызывает достоверных изменений исследованных биохимических показателей крови по сравнению с интактными животными и животными, получавшими мазевую основу.

Функциональная активность печени. Крысам-самкам Вистар массой 200-230 г ежедневно в течение 3-х месяцев наносили мази с 13цРК в различных концентрациях (таблица 2). Функциональную активность печени оценивали по тесту с гексеналовым наркозом (80 мг/кг внутрибрюшинно).

Установлено, что мази с 13цРК не влияют на способность печени метаболизировать гексенал и, следовательно, не угнетают функцию органа.

Функциональная активность почек.Условия постановки опыта такие же, как и в предыдущем опыте. Функциональную активность почек оценивали по объему мочи, выделенной в течение 3-х часов после однократного внутрижелудочного введения 3 мл воды. Результаты исследования, представленные в таблице 3, позволяют считать, что применение в течение длительного срока мазей с 13цРК не снижает способности почек формировать остаточную мочу.

Функциональная активность иммунной системы. Половозрелым мышам-самцам СВА и С57Вl массой 18-20 г на кожу уха наносили по 0,2 г мази, содержащей 0,01%, 0,1%, 0,5% или 1% 13цРК. В суспензии спленоцитов оценивали процентное содержание Т- и В-лимфоцитов, выявленных реакцией непрямой иммунофлюоресценции с использованием козьих антител против Т- и В-лимфоцитов мыши и кроличьих антител против иммуноглобулинов козы, меченных флюоресцеина изотиоцианатом. О состоянии фагоцитарной системы судили по активности кислородного метаболизма макрофагов в тесте спонтанной хемилюминесценции, динамике хемилюминесценции при фагоцитозе корпускулярного активатора - зимозана и при индукции респираторного взрыва растворимым активатором - форболмиристатацетатом (ФМА).

Накожные аппликации мазей с 13цРК в концентрациях 0,01%; 0.1% и 0.5% (или соответственно по 1, 10 и 50 мг/кг) не вызывали иммунотоксических эффектов у мышей двух оппозитивных линий. При местном применении эти мази повышают содержание Т-лимфоцитов в популяции селезеночных клеток мышей линии СВА. У мышей обеих использованных линий нанесение мазей на кожу приводит к стимуляции спонтанной и индуцированной хемилюминесценции резидентных перитонеальных макрофагов, что свидетельствует об усилении их кислородного метаболизма и фагоцитарной активности.

Обнаруженные изменения количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток являются дозозависимыми и нарастают пропорционально дозе введенного вещества. Дозировка препарата 100 мг/кг (1% мазь), более чем в 10 раз превышающая среднюю терапевтическую дозу, применяемую у человека, является пороговой, при применении которой эффект активации иммунокомпетентных клеток перестает проявляться. Существенного подавления иммунитета при этом, однако, не происходит.

Структурные изменения органов и органных систем. Крысам-самкам Вистар массой 200-250 г ежедневно в течение 3 месяцев наносили 0,01%; 0,05% или 0,1% ретиноевую мазь. Контролем служили интактные животные и животные, получавшие мазевую основу. Все крысы дожили до конца исследования. Эвтаназию животных проводили на 30-й, 60-й и 90-й дни опыта передозировкой хлороформа.

Анализ органно-соматических показателей позволил заключить, что мазь с 13цРК в концентрациях от 0,01 % до 0,1 % не оказывает существенного влияния на массу сердца, легких, печени, почек, селезенки и тимуса.

Видимых морфологических изменений в органах нервной системы (нервы кожи, нервные ганглии и нервные волокна желудка и кишечника, нейроны сетчатой оболочки, спинного мозга и головного мозга) и сердечно-сосудистой системы (сердце, артерии и вены кожи, печени, почек, селезенки, кишечника, легких) не выявлено.

В легких наблюдались явления гиперемии, усиление периваскулярной и перибронхиальной инфильтрации клетками мононуклеарного ряда, увеличение количества макрофагов и лимфоцитов в стенках альвеол. Изменения носили дозозависимый характер.

В почках на 30-е сутки опыта наблюдалось полнокровие сосудов, расширение полости капсул нефронов, а в отдельных (не более 5%) почечных тельцах - сморщивание сосудистых клубочков. Через 60 дней изменения были более выраженными. В соединительной ткани обнаруживались многочисленные макрофаги с высоким уровнем фагоцитоза коллоидного угля. Максимальные морфологические сдвиги в структуре нефронов наблюдались к 90-м суткам эксперимента, причем они были наиболее выражены в группе животных, получавших 0,1% ретиноевую мазь (многие почечные тельца деформированы, проксимально канальцы лишены щеточной каймы).

В печени к 30-му дню исследования развивалась умеренная очаговая лимфоидная инфильтрация периваскулярной соединительной ткани, снижалось число макрофагов с высокой фагоцитарной активностью. Подобные изменения сохранялись на протяжении последующих 30 суток. К 90-му дню опыта в гепатоцитах, преимущественно локализованных на периферии долек, возникали признаки вакуольной и балонной дистрофии. Изменения в печени имели дозозависимый характер.

В поджелудочной железе к 60-му и в большей степени к 90-му дню эксперимента наблюдалось дозозависимое увеличение размеров островков Лангерганса.

В кишечнике наблюдалось усиление мононуклеарноклеточной инфильтрации соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки, а также снижение содержания бокаловидных клеток в покровном эпителии. Наиболее отчетливо эти эффекты проявлялись к 30-му и 60-му дням опыта. Видимых изменений в гистоструктуре желудка не обнаружено.

Длительное, в течение 90 дней, применение ретиноевых мазей приводило к атрофии надпочечников (площадь как коркового так и мозгового вещества снижалась). Эффект нарастал с увеличением дозы вещества. В щитовидной железе наблюдалось также дозозависимое увеличение содержания и размеров межфолликулярной паренхимы.

В тимусе к 90-му дню исследования отмечено расширение коркового и сужение мозгового вещества, стирание границ между ними. В лимфатических узлах - высокое содержание макрофагов, накапливающих частицы коллоидного угля. В селезенке выявлены дозозависимые изменения объема белой пульпы: к 30-му дню исследовния в органе преобладали мелкие лимфоидные фолликулы, к 60-му дню они достигали наиболее крупных размеров, а к 90-му дню - вновь становились мелкими (особенно на высоких дозах 13цРК). При этом граница между белой и красной пульпой становилась менее выраженной.

Таким образом, длительное накожное нанесение мази с 13цРК сопровождается деструктивными изменениями ряда внутренних органов (печень, почка, легкие, надпочечники). Повреждающее действие нарастает с увеличением дозы лекарственного вещества в препарате. Выявленные изменения гистоструктуры органов иммунной системы вероятно отражают дозозависимое иммуномодулирующее действие 13цРК. Оценивая эти данные, следует учитывать, что в эксперименте использовались мази с таким содержанием 13цРК, которое предназначено для лечения определенной группы кожных заболеваний у человека. Животные в данном опыте получали в пересчете на массу тела несравненно более высокие (более чем в 350 раз) дозы субстанции, чем это может иметь место у человека.

Местнораздражающее действие

Беспородным пятнистым морским свинкам обоего пола массой 230-250 г в течение 10 дней наносили на кожу по 0,5 мл 0,25 % спирто-глицеринового раствора 13цРК (испытание вещества в виде субстанции). К 6-му дню опыта у всех животных на месте нанесения раствора возникли гиперемия и отек дермы, утолщение эпидермиса. В последующие дни в месте аппликации раствора возникли участки изъязвлений. На 10-й день опыт был прекращен и образцы кожи подвергнуты гистологическому анализу. Отмечено неравномерное истончение эпидермиса: участки с полным разрушением эпителиоцитов чередовались с участками гиперплазии и гиперкератинизации покровного эпителия. В дерме наблюдались гиперемия и отек, выраженная полиморфноклеточная инфильтрация. Эти данные указывают на повреждающее действие высоких доз 13цРК на кожу.

Местнораздражающее действие мази, содержащей 13цРК, изучали на беспородных морских свинках-самках массой 300-350 г в модели ежедневных накожных аппликаций. Реакцию оценивали по шкале парных баллов (таблица 4).

*первое число - интенсивность эритемы, второе - интенсивность отказа.

Установлено, что, начиная с 6-го дня, 10% ретиноевая мазь вызывает в месте нанесения эритему и отек, что свидетельствует о ее кожнораздражающем действии.

Мышам-самцам CBA и C57Bl в течение 10 дней на кожу уха наносили по 0,2 г ретиноевой мази 0,01%, 0,1%, 0,5% или 1,0%. Контролем служили интактные животные и животные, получавшие мазевую основу. Микроскопические признаки местнораздражающего действия возникали начиная с 5-го дня опыта и выражались в гиперемии и деформации ушной раковины, умеренном гиперкератозе эпидермиса. Признаки системной токсичности (потеря в весе, повышенное потребление воды) проявились только при аппликации 1% ретиноевой мази.

Аллергизирующее действие

Белым беспородным морским свинкам массой 300-350 г на кожу боковой поверхности туловища ежедневно в течение 10 дней наносили мази с 13цРК в различной концентрации. На 11-е сутки на кожу противоположной стороны тела наносили разрешающую дозу препарата с той же концентрацией 13цРК. Реакцию учитывали по возникновению и выраженности эритемы и отека в месте тестирования (таблица 5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что мазевая форма 13цРК в указанных концентрациях не вызывает сенсибилизации морских свинок.

Канцерогенное действие

В опытах in vitro использовали культуру эмбриональных клеток человека ЛЕП-19. Критерием оценки служила трансформация клеток, вызванная циклофосфамидом в нетоксической (10 мкг/мл) концентрации. Перед началом эксперимента определяли цитотоксичность 13цРК (10 мкг/мл). В качестве культуральной среды использовали среду Л-15 с добавлением телячей сыворотки и глютатиона. Клеточную плотность и цитосруктуру оценивали через 48 и 96 часов инкубации, что приблизительно соответствует вершине логарифмической фазы роста клеток.

Клетки в культурах, подвергнутых действию канцерогена, уже к 48 часу инкубации имели признаки трансформации - потеря первоначальной фибробластической формы, нарушение контактного торможения.

13цРК не оказывала на клетки цитотоксического действия: клеточная плотность в контрольной и опытной сериях была близкой. При исследовании морфологии клеток, культивировавшихся в среде с добавлением 13цРК, изменения, свидетельствующие о их трансформации, зарегистрированы не были. Клетки сохраняли типичную фибробластическую структуру. Следовательно, в избранной дозе (10 мкг/мл) 13цРК не проявляла ни цитотоксического, ни канцерогенного действия на клетки линии ЛЕП-19.

В опытах in vivo, поставленных на мышах-самцах линии BAСв/с, в качестве канцерогена использовали раствор ДМБА (9,10 - диметилбензантрацен) в ацетоне, который наносили на межлопаточную область спины в дозе 200 мкг на животное один раз в неделю в течение 5 недель. В течение последующего месяца учитывали количество образовавшихся папиллом. 13цРК (0,1%) в виде мази и ацетонового раствора апплицировали на кожу в месте нанесения канцерогена ежедневно на протяжении всего опыта.

Установлено (таблица 6), что 13цРК в растворе и в составе мази не обладает самостоятельным канцерогенным эффектом. Одновременное нанесение на кожу ДМБА и 13цРК тормозит химический канцерогенез.

Мутагенное действие

Возможное мутагенное действие 13цРК исследовали на чистой ДНК плазмиды pBR 322, которая представляет собой кольцевую молекулу, содержащую два гена устойчивости к антибиотикам Tetr и Ampr, кодирующие биосинтез соответствующих ферментов. При инкубации 13цРК с чистой ДНК pBR 322 снижения числа трансформантов E.Coli при высеве на соответствующие среды не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии изменений указанных генов и, следовательно, об отсутствии мутагенного эффекта вещества.

Для полного исследования мутагенного действия 13цРК была взята ДНК одноцепочечного бактериофага М13. Эта ДНК содержит от 8 до 10 генов, кодирующих синтез белков оболочки и ферментов, участвующих в редупликации генетического материала бактериофага. Мутагенное действие исследуемого вещества могло выражаться как в резком снижении общего количества фаговых бляшек на газоне клеток XL, так и в уменьшении размеров бляшек по сравнению с контрольным опытом. Такого эффекта 13цРК при совместной инкубации с ДНК фага не давала. Некоторое снижение числа бляшек при максимальных концентрациях 13цРК скорее является следствием ее общего угнетающего действия на рост клеток, либо влиянием непосредственно на компетентные клетки, приводящим к ухудшению их восприимчивости к ДНК фага. Для исследования токсичности 13цРК чашки Петри заливали LB-агаром с постепенно возрастающими концентрациями вещества. После подбора титра ночной культуры клеток JM109 ее разбавляли в соответствующее число раз и высеивали на чашки так, чтобы получилось от 100 до 400 колоний. Чашки инкубировали ночь при 370 С. Результаты опыта показали, что препарат слабо токсичен при максимальных концентрациях - изменение титра не превышает 10 - 20 %.

В результате проведенных экспериментов, в которых было проанализировано влияние 13цРК на ряд генов E.Coli, кодирующих ферменты и белки, можно сделать вывод, что исследуемое вещество не обладает мутагенным действием. При максимальных концентрациях 13цРК обладала слабым токсическим действием, угнетающим рост E. Coli.

В опыте in vivo ежедневно в течение 2-х недель мышам-самкам АКР наносили на кожу по 0,5 г 0,1% ретиноевой мази. В мазках красного костного мозга подсчитывали количество делящихся клеток миелоидного и эритроидного рядов на стадии метафазы, учитывая одновременно число клеток с удлиненными или укороченными хромосомами. Установлено, что в сравнении с интактными животными и животными, получавшими мазевую основу, местное применение мази с 13цРК не влияет на количество кроветворных клеток с аномальными хромосомами.

Таким образом, мазь с 13цРК не обладает мутагенным действием.

Лечение отравлений, связанных с передозировкой 13цРК

По данным литературы (Терруан, 1969; Машковцев, Ноздрин, 1970; Ноздрин и др., 1978) способностью снижать токсические свойства препаратов витамина А обладают витамин Е и гидрокортизон. Поэтому антидотные свойства при отравлении 13цРК были изучены именно у этих соединений.

Мышам-самцам CBWA массой 20±1 г однократно вводили ректальные свечи, содержащие 13цРК. Антидоты в виде коммерческих лекарственных форм (масляный раствор витамина Е, суспензия гидрокортизона) вводили внутрибрюшинно.

Витамин Е (a-токоферол) отличается малой токсичностью, поэтому величину его максимально переносимой дозы (МПД) определить не удалось - от однократной дозы в 6000 мг/кг животные не гибли. Дальнейшее повышение дозы витамина Е было признано нецелесообразным из-за больших объемов вводимого растворителя. В остром опыте a-токоферол в дозе 2000 мг/кг снижал гибель животных, получавших 13цРК (3000 мг/кг), с 70% до 25 %.

Величина МПД для гидрокортизона была ниже 300 мг/кг и выше 50 мг/кг. Для исследования антидотного действия гидрокортизон использовали в дозе 50 мг/кг. Установлено, что препарат снижал гибель животных, получавших 13цРК (2000 мг/кг), с 50% до 25 %.

Таким образом, гидрокортизон и витамин Е в высоких дозах способны снижать острую токсичность ректальных свечей, содержащих 13цРК.

Крысам-самкам Вистар массой 180-200 г раз в сутки в течение 7 дней наносили на кожу по 0,5 г 0,1%, 0,5%, 1% или 2% ретиноевой мази. Через 2 часа после этого на те же участки кожи накладывали около 0,5 г 1% гидрокортизоновой мази (коммерческий препарат). Гидрокортизоновая мазь задерживала проявления местнораздражающего действия 13цРК.

Следовательно гидрокортизон может уменьшать общее и местное проявление токсичности 13цРК.

О.Л. Иванов, О.В. Грабовская