Авторы: Г. А. Пьявченко^1,2, В. А. Пугач³, Н. С. Новикова³, Л. И. Шмаркова⁴, Е. А. Корнева³, В. И. Ноздрин^1,2

¹ Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии (зав. – проф. В. И. Ноздрин), Медицинский институт, Орловский государственный университет имени И. С. Тургенева;
² Научный отдел (руков. – канд. биол. наук Г. В. Трунова), Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Ретиноиды», Москва;
³ Отдел общей патологии и патофизиологии (зав. – д.б.н. О. В. Шамова), ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»;
⁴ Кафедра математики, информатики и информационных технологий (зав. – проф. Л. И. Малявкина), Орловский государственный университет экономики и торговли.

---

Резюме

Выявление c-Fos позитивных нейронов в различных участках головного мозга и изучение поведенческих реакций лабораторных крыс в условиях накожного нанесения пасты с содержанием 5% антисептика-стимулятора Дорогова 3 фракции показало активацию нейронов цингулярной, моторной, пириформной коры и стриатума, увеличение двигательной и ультразвуковой активности, а также продемонстрировало наличие корреляционной зависимости поведенческих реакций от активации нейронов в изучаемых зонах мозга. Результаты свидетельствуют о совместной регуляции поведения многими структурами мозга и о наличии у Препарата нейротропного эффекта.

Ключевые слова: цингулярная, моторная, пириформная кора, стриатум, антисептик-стимулятор Дорогова, c-Fos, поведенческие реакции.

---

Упоминания об антисептике-стимуляторе приходятся на первую половину прошлого века, когда он был получен А. В. Дороговым путем глубокого термического разложения тканей животных (АСД). По результатам проведенных исследований на животных и человеке был описан широкий положительный фармакологический эффект, охватывающий в том числе заболевания кожи (экзема, нейродермит, псориаз, аллергодерматозы и др.). При этом отмечен общий стимулирующий эффект на нервную систему [3]. Фармакологическая характеристика фракций препарата подтверждала данные о влиянии АСД на нервную систему, указывая на мускарино-, никотино- и холиномиметический эффект от нанесения препарата [1]. Морфологические проявления этого эффекта изучены не были. Известно, что поведенческие акты регулируются взаимодействием многих структур мозга. Основываясь на данных литературы [16, 21], были выбраны следующие функциональные зоны мозга: цингулярная кора – ответственна за сложные поведенческие реакции и ультразвуковые вокализации, моторная – регулирует четкие, избирательные движения, лежащие в основе поведения, соматосенсорная – чувствительность от большинства рецепторов тела, инсулярная – ответственна за процесс принятия решений, эмоциональный контроль за поведением и является центром регуляции зависимости от наркотических веществ, пириформная кора ответственна за эмоциональный контроль за поведением и стриатум, который участвует в регуляции сложных поведенческих актов, в работе внутренних органов. Для гистологической оценки степени активации нейронов мозга в настоящее время используют определение содержания белка c-Fos (маркер ранней нейральной активации) [8, 10, 11, 20].

Целью настоящего исследования стало изучение морфологических изменений нервных клеток в коре и стриатуме головного мозга крыс после накожного нанесения цинковой пасты с 5% АСД 3 фракции (Препарат). В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Дать морфологическую характеристику изменений коры и стриатума головного мозга крыс при накожном нанесении Препарата;
• Проанализировать особенности поведенческих реакций крыс при накожном нанесении Препарата;
• Проследить в этих условиях наличие корреляционных связей между активацией нейронов коры и стриатума и поведенческими актами животных после накожного нанесения Препарата.

Материалы и методы

Исследование проводили на крысах-самцах линии Sprague Dawley массой 100-120 г. (n=6 в группе), полученных из питомника филиала ИБХ РАН «Пущино». Животных содержали в условиях вивария Центра доклинических исследований АО «Ретиноиды». Основные правила содержания и ухода за крысами соответствовали правилам по устройству, оборудованию и содержанию вивариев [4]. Процедуры по уходу за животными выполняли в соответствии со стандартными операционными процедурами. Крысы находились в контролируемых условиях окружающей среды и получали полнорационный гранулированный комбикорм и очищенную воду без ограничений. Перед исследованием животных помещали в отдельное помещение на период адаптации в течение 14 дней. После рандомизации и идентификации крыс разделяли на следующие группы: группа 1 – интактные животные; группа 2 – животные, получавшие основу препарата (цинковая паста) и группа 3 – животные, получавшие Препарат. Животным 2 и 3 групп выбривали участок межлопаточной области спины площадью 4 см². Основу и препарат в дозе 2 г/кг наносили 2 раза в сутки в течение 7 дней. Через 2 часа после последнего нанесения в течение 15 минут проводили запись двигательной активности, ультразвуковых вокализаций (УЗВ) и надпороговых криков на синхронизированном по времени комплексе Laboras-Sonotrack (Metris, Нидерланды) [6]. В дальнейшем животных наркотизировали препаратом Золетил 100 (Virbac, Франция). После интракардиальной перфузии иммунофикса (Bio-Optica, Италия) головной мозг фиксировали в течение часа и переносили в 15% раствор сахарозы на иммунофиксе. Срезы толщиной 40 µm получали на микротоме Thermo Scientific HM430 (Microm GmbH, Германия) с устройством быстрого замораживания KS 34. C-Fos-позитивные (активированные) клетки выявляли авидин-биотиновым методом с детекцией 3,3’-диаминобензидином (Santa Cruz, США).

Объектами исследования служили цингулярная, моторная, соматосенсорная, инсулярная, пириформная кора и стриатум (Рис. 1), соответствующие 13-17 уровням срезов мозга по атласу Paxinos and Watson [15]. Подсчёт c-Fos-позитивных клеток проводили в 3 полях зрения для каждого животного (об. 40, ок., 20) при помощи программного обеспечения AxioVision (Carl Zeiss, Германия) на микроскопе Axioskop 2 (Carl Zeiss, Германия). Статистический анализ достоверности различий средних величин (M±m, t-критерий Стьюдента), а также анализ корреляционной зависимости поведенческих реакций от количества нейронов (коэффициент корреляции r) проводили с помощью программы Statistica, версия 6,1 [7].

Результаты исследования

Экспрессия гена c-Fos была выявлена в фоновом количестве у крыс из 1-й группы. У животных из 2-й группы наблюдалось большее количество c-Fos-позитивных нейронов, в особенности – в моторной и соматосенсорной коре. Крысы, получавшие Препарат, показали резкое увеличение количества активированных нейронов во всех исследуемых зонах (рис. 4), особенно, в цингулярной, моторной, пириформной коре и стриатуме (рис. 2-3). Результаты анализа поведенческой активности крыс после применения Препарата демонстрируют увеличение продолжительности и скорости движения, пройденного расстояния, а также общего количества зарегистрированных поведенческих актов (табл. 1). Анализ показателей УЗВ показал, что крысы из 3-й группы издают ультразвуков больше и ниже – по частоте (табл. 2). Корреляционный анализ в группе животных, получавших Препарат, выявил наличие достоверной зависимости между числом c-Fos-позитивных нейронов и поведенческой активностью крыс (табл. 3).

Обсуждение полученных данных

В настоящем исследовании обнаружена связь между активацией нейронов моторной, пириформной коры и стриатума головного мозга крыс и их средней скоростью движения, что подтверждает наличие кортико-стриальных и кортико-кортикальных взаимодействий головного мозга. Эти данные согласуются с результатами исследований на лабораторных грызунах, обобщенных в монографии C. Watson, G. Paxinos и L. Puelles [21]. Наличие подобных связей в своих работах описывают и другие авторы [13, 19]. Корреляционный анализ выявил наличие связи между количеством активированных нейронов моторной, пириформной коры и стриатума и двигательной активностью лабораторных крыс. Этот факт подтверждает многочисленные литературные данные о связях коры и подкорковых ядер головного мозга в осуществлении двигательных актов и их регуляции [2, 5, 12, 14]. В работе показано, что накожное нанесение Препарата сопровождается активацией нейронов стриатума, цингулярной, моторной и пириформной коры и изменением в поведении. A. Sayin и др. [18] в своем исследовании отмечают, что введение крысам-самкам циталопрама коррелирует с тревожным поведением и увеличением содержания c-Fos позитивных нейронов в цингулярной коре, миндалевидном теле и паравентрикулярном таламическом ядре. О том же говорят результаты исследования O. Babaev и др. [9], согласно которым, воздействие на белки нейролигины приводит к активации c-Fos-позитивных нейронов в зонах, ассоциирующихся с тревогой.

В нашем исследовании выявлена корреляционная связь между количеством c-Fos-позитивных нейронов цингулярной коры и параметрами ультразвуковых вокализаций в группе животных, получавших Препарат. В статье S. S. Pertsov и др. [17] также отмечено, что различные эмоциональные состояния у крыс сопровождаются изменениями параметров УЗВ, регистрируемых комплексом Sonotrack. Увеличение содержания индуцибельного белка c-Fos в соматосенсорной и инсулярной коре свидетельствует об активации нейронов в ответ на процесс накожного нанесения Препарата и связанными с этим ощущениями.

Заключение

Нанесение цинковой пасты с 5% АСД 3 фракции на кожу межлопаточной области крыс линии Sprague Dawley приводит к значительному увеличению числа активированных, c-Fos-позитивных нейронов в цингулярной, моторной, инсулярной и пириформной коре, а также – в полосатом теле головного мозга и к увеличению двигательной и ультразвуковой активности крыс. Результаты корреляционного анализа позволяют говорить о высокой степени вероятности наличия связи между количеством активированных нейронов и поведенческой активностью животного.

^* P≤0,05, по сравнению с 1 группой
^# P≤0,05, по сравнению со 2 группой

^* P≤0,05, по сравнению с 1 группой
^# P≤0,05, по сравнению со 2 группой

^* – указывает на обратную корреляционную зависимость.

Литература

1. Дерябина З. И., Николаев А. В. Химико-фармакологическая характеристика препарата АСД. Труды Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. М., 1968, т. 35, с. 326-339.
2. Ивлиев Д. А. Влияние микроинъекции атропина в моторную кору крысы на выработку двигательного навыка. Журнал высшей нервной деятельности им. И. П. Павлова, 1998, № 3, с. 478-484.
3. Леонов Н. И. Новое в тканевой терапии. Наука и жизнь, 1951, № 8, с. 17-19.
4. Ноздрин В. И., Пьявченко Г. А. Опыт проведения доклинических исследований лекарственных препаратов дерматотропного действия. Технологии живых систем, 2013, т. 10, № 8, с. 31-37.
5. Перекрест С. В., Гаврилов Ю. В., Абрамова Т. В., Новикова Н. С., Корнева Е. А. Активация клеток гипоталамических структур при введении антигенов различной природы (по экспрессии c-Fos гена). Медицинская иммунология, 2006, т. 8, №5-6, с. 631-636.
6. Пьявченко Г. А., Урываев Ю. В., Ноздрин В. И. Совместное применение комплексов Laboras и Sonotrack при исследовании поведенческих реакций у крыс. Учёные записки Орловского государственного университета, 2013, т. 56, № 6, с. 238–242
7. Пьявченко Г. А., Шмаркова Л. И., Ноздрин В. И. Изменение количества нейронов в моторной коре крыс и их двигательная активность в возрастном аспекте. Морфология, 2015, т. 147, вып. 3, с. 7-10.
8. Сварник О. Е. Формирование индивидуального опыта и его нейрогенетическое обеспечение: экспрессия гена c-fos. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук. Москва, 2003, 28 с.
9. Babaev O., Botta P., Meyer E., Müller C., Ehrenreich H., Brose N., Lüthi A., Krueger-Burg D. Neuroligin 2 deletion alters inhibitory synapse function and anxiety-associated neuronal activation in the amygdala. Neuropharmacology, 2016, vol. 100, pp. 56-65.
10. Binder M. D., Hirokawa N., Windhorst U. Encyclopedia of Neuroscience. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009, p. 685.
11. Carter M., Shieh J. C. Guide to Research Techniques in Neuroscience. San Diego. Elsevier Academic Press, 2nd edition, 2015, pp. 168-169.
12. Hearing M. C., See R. E., McGinty J. F. Relapse to cocaine-seeking increases activity-regulated gene expression differentially in the striatum and cerebral cortex of rats following short or long periods of abstinence. Brain Structure and Function, 2008, vol. 213, № 1-2, pp. 215-227.
13. Matyas F., Sreenivasan V., Marbach F., et al. Motor control by sensory cortex. Science, 2010, vol. 330, pp. 1240-1243.
14. Murray R. C., Gilbert Y. E., Logan A. S., et al. Strial patch compartment lesions alter methamphetamine-induced behavior and immediate early gene expression in the striatum, substantia nigra and frontal cortex. Brain Structure and Function, 2014, vol. 219, № 4, pp. 1213-1229.
15. Paxinos G., Watson C. The rat atlas in stereotaxic coordinates. San Diego. Elsevier Academic Press, 6th edition, 2007, 456 p.
16. Paxinos G. The rat nervous system. San Diego. Elsevier Academic Press, 3rd edition, 2004, 1309 p.
17. Pertsov S. S., Koplik E. V., Karkishchenko N. N., Sudakov K. V. Ultrasonic vocalization of rats in various motivational and emotional states. Bulletin of experimental biology and medicine, 2012, vol. 153, №6, pp. 805-808.
18. Sayin A., Derinöz O., Yüksel N., Şahin S., Bolay H. The effects of the estrus cycle and citalopram on anxiety-like behaviors and c-fos expression in rats. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 2014, vol. 124, pp. 180–187.
19. Sippy T., Lapray D., Crochet S., Petersen C. H. Cell-type-specific sensorimotor processing in striatal projection neurons during goal-directed behavior. Neuron, 2015, vol. 88, pp. 1-8.
20. Squire L. R., Berg D., Bloom F. E., Lac S., et al. Fundamental neuroscience. San Diego. Elsevier Academic Press, 2013, 4th ed, p. 207.
21. Watson C., Paxinos G., Puelles L. The Mouse Nervous System. San Diego. Elsevier Academic Press, 2011, 814 p.